魏海燕 曾靜 張偉 劉建禮 梁新苗 李東燕 劉來福
(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026)
ELISA檢測(cè)試劑盒在出入境檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用與質(zhì)控
魏海燕 曾靜 張偉 劉建禮 梁新苗 李東燕 劉來福*
(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026)
介紹了ELISA檢測(cè)試劑盒在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用情況、面臨的問題及當(dāng)前的監(jiān)管現(xiàn)狀,并探討了ELISA檢測(cè)試劑盒的質(zhì)控評(píng)價(jià)方法。
ELISA;試劑盒;檢驗(yàn)檢疫;應(yīng)用;質(zhì)控
自從Engvall和Perlmann(1971)首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)[1](Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)以來,隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新,加之電腦化程度極高的ELISA檢測(cè)儀的使用,使ELISA更為簡(jiǎn)便實(shí)用,尤其是商品化ELISA檢測(cè)試劑盒的問世,進(jìn)一步推動(dòng)了檢測(cè)領(lǐng)域自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化和高通量的發(fā)展進(jìn)程,使其廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品安全檢測(cè)、出入境檢疫、環(huán)境監(jiān)控等領(lǐng)域。
目前ELISA檢測(cè)試劑盒在我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用范圍覆蓋食品安全檢測(cè)、動(dòng)物檢疫、植物檢疫和衛(wèi)生檢疫等領(lǐng)域。如食品安全檢測(cè)領(lǐng)域針對(duì)食品中的過敏原、維生素、轉(zhuǎn)基因成分、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、生物毒素、致病微生物檢測(cè)的ELISA試劑盒;動(dòng)物檢疫方面豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病等的ELISA檢測(cè)試劑盒;植物檢疫中針對(duì)植物病毒、細(xì)菌、真菌、植物激素進(jìn)行檢測(cè)的ELISA試劑盒;衛(wèi)生檢疫中細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒、內(nèi)分泌檢測(cè)試劑盒、自身免疫檢測(cè)試劑盒、傳染病檢測(cè)試劑盒、特種蛋白檢測(cè)試劑盒、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)試劑盒等??梢?,ELISA檢測(cè)試劑盒已成為國(guó)境檢驗(yàn)檢疫安全偵檢技術(shù)體系中的重要組成,是有害生物及有毒有害物質(zhì)檢測(cè)不可或缺的重要技術(shù)手段,極其適合出入境檢驗(yàn)檢疫對(duì)大量樣品快速篩查的需求。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫中應(yīng)用的ELISA檢測(cè)試劑盒多達(dá)200余種,尤其在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域中的應(yīng)用最為廣泛。
出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域所涉及的ELISA試劑盒根據(jù)其所用的固相載體可區(qū)分為3大類型:①采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA試劑盒,即通常所指的微量板ELISA試劑盒,也是目前應(yīng)用最多的一種;②用硝酸纖維膜為載體的ELISA試劑盒,又稱斑點(diǎn)ELISA試劑盒;③采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA試劑盒,稱為布ELISA試劑盒。在微量板ELISA試劑盒中,又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA試劑盒、雙抗體夾心ELISA試劑盒、雙夾心ELISA試劑盒、競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒、阻斷ELISA試劑盒及抗體捕捉ELISA試劑盒等。此外,商品化ELISA檢測(cè)試劑盒還可分為定性檢測(cè)用與定量檢測(cè)用兩種,前者試驗(yàn)出具的檢測(cè)報(bào)告僅出具陰性與陽性的判斷結(jié)果,不報(bào)送具體檢測(cè)數(shù)值,后者試驗(yàn)出具的檢測(cè)報(bào)告報(bào)送在檢測(cè)限以上的檢測(cè)數(shù)值,當(dāng)前檢驗(yàn)檢疫中所使用的ELISA檢測(cè)試劑盒主要是定性檢測(cè)。
通過調(diào)研發(fā)現(xiàn),當(dāng)前出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域所使用的ELISA檢測(cè)試劑盒多依賴于進(jìn)口產(chǎn)品,其生產(chǎn)商多是發(fā)達(dá)國(guó)家的一些大型老牌生物或制藥公司,如法國(guó)生物梅里埃、美國(guó)AGDIA公司、德國(guó)拜發(fā)公司等。這些進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴,一個(gè)96孔ELISA檢測(cè)試劑盒通常需要5 000-6 000元,較高的檢測(cè)成本限制了檢測(cè)工作的開展和檢測(cè)技術(shù)的推廣;此外,試劑盒進(jìn)口周期一般較長(zhǎng),難以應(yīng)對(duì)緊急突發(fā)事件;某些試劑盒進(jìn)口渠道有限,甚至無法進(jìn)口,導(dǎo)致某些檢測(cè)項(xiàng)目只有送到國(guó)外才能確認(rèn)。盡管如此,這些試劑盒在檢測(cè)人員尤其是官方實(shí)驗(yàn)室和第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)中的認(rèn)同率仍然非常高。分析其原因主要是由于其可靠的質(zhì)量保障,這些產(chǎn)品在入市前大都經(jīng)過了一些官方或權(quán)威機(jī)構(gòu)的認(rèn)證,如AOAC、AFNOR等。與之相比,國(guó)內(nèi)ELISA檢測(cè)產(chǎn)品,大都未經(jīng)過相關(guān)組織認(rèn)證,產(chǎn)品關(guān)鍵性能指標(biāo)和穩(wěn)定性缺乏有效的數(shù)據(jù)支撐,市場(chǎng)占有率較低。
3國(guó)產(chǎn)ELISA檢測(cè)試劑盒在應(yīng)用中面臨的問題
近年來國(guó)產(chǎn)ELISA檢測(cè)試劑盒得到了飛速發(fā)展,應(yīng)用范圍日趨廣泛,產(chǎn)業(yè)化規(guī)模不斷擴(kuò)大,在某些領(lǐng)域甚至具有不可替代性,但同時(shí)也出現(xiàn)了一些不可忽視的隱患。首先,ELISA試劑盒的研發(fā)與生產(chǎn)成本較低,投入產(chǎn)出值較高,研發(fā)周期相對(duì)較短,一些水平低、規(guī)模小、管理差的企業(yè)也紛紛加入生產(chǎn)行列,市場(chǎng)上的產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊。其次,對(duì)ELISA檢測(cè)試劑盒缺乏完備的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證體系,絕大多數(shù)的ELISA檢測(cè)試劑盒處于監(jiān)管缺失狀態(tài),產(chǎn)品市場(chǎng)準(zhǔn)入門檻低,一些低劣的ELISA檢測(cè)試劑盒甚至未經(jīng)方法學(xué)評(píng)價(jià)就涌入市場(chǎng),對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性帶來了巨大隱患。此外,ELISA檢測(cè)試劑盒涉及抗體等生物活性分子,抗體效價(jià)高低、特異性強(qiáng)弱,穩(wěn)定性好壞都將直接影響檢測(cè)結(jié)果??梢姡珽LISA試劑盒的質(zhì)量把關(guān)是保障檢測(cè)結(jié)果的可靠性、可比性和權(quán)威性的重要前提,尤其對(duì)于“憑技術(shù)執(zhí)法、靠數(shù)據(jù)說話”的檢驗(yàn)檢疫工作而言更是有著舉足輕重的作用。選用可靠的ELISA檢測(cè)試劑盒有助于提高我國(guó)檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室的競(jìng)爭(zhēng)力,提升政府信任度,促進(jìn)檢測(cè)結(jié)果的國(guó)際互認(rèn),沖破國(guó)外技術(shù)壁壘,樹立我國(guó)的地位和形象,推動(dòng)進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展。
國(guó)內(nèi)近幾年開始重視針對(duì)試劑盒的管理工作,如農(nóng)業(yè)部對(duì)獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒進(jìn)行備案管理[2,3],國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局對(duì)體外診斷試劑實(shí)行分類注冊(cè)管理[4,5],國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局則發(fā)布了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》(SN/T 2775-2011),對(duì)商品化食品安全檢測(cè)試劑盒市場(chǎng)準(zhǔn)入及管理方面作出了規(guī)定[6]。雖然三個(gè)部門對(duì)不同領(lǐng)域試劑盒的監(jiān)管均有涉及ELISA檢測(cè)產(chǎn)品,但尚未能建立成熟的專門針對(duì)ELISA檢測(cè)試劑盒的監(jiān)管體系,在許多領(lǐng)域仍存在監(jiān)管空白。
ELISA檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量控制在其生產(chǎn)和應(yīng)用中都具有重要的意義,便于ELISA檢測(cè)試劑盒生產(chǎn)企業(yè)及用戶在生產(chǎn)或使用時(shí)對(duì)相關(guān)技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià),維護(hù)產(chǎn)品質(zhì)量,了解使用該試劑盒對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,保障檢測(cè)結(jié)果的可靠性。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)ELISA檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)方面的研究多涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,使用的方法也不盡相同[7]。而國(guó)外一些知名的國(guó)際組織或?qū)W會(huì)自20世紀(jì)80年代以來紛紛建立了較為完整的針對(duì)商品化試劑盒的評(píng)價(jià)程序,更為注重對(duì)于采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可以滿足的方法學(xué)指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn),其中較為有名的如國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)的評(píng)價(jià)方法[8,9]。ELISA試劑盒種類繁多,技術(shù)原理多樣,在實(shí)際的驗(yàn)證工作中可根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)、應(yīng)用范圍、針對(duì)的目標(biāo)物和適用的檢測(cè)基體,綜合參考ISO、AOAC的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范,從保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性入手,從檢測(cè)技術(shù)性能指標(biāo)對(duì)ELISA試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如,以食品中致病微生物的ELISA檢測(cè)試劑盒為例,可從以下幾個(gè)指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。
4.1相對(duì)精確度、相對(duì)靈敏度、相對(duì)特異性
根據(jù)ELISA試劑盒的適用范圍和用戶自身的要求選擇需驗(yàn)證的食品種類,食品樣品的來源要盡可能廣,包括不同地域,避免地域上的偏差。如選用自然污染的樣品要盡可能代表該類食品通常的污染水平,尤其是污染范圍的低限;如果無法獲得足夠數(shù)量的自然污染樣品,也可使用人工污染的食品樣品,這種樣品污染水平應(yīng)與ELISA試劑盒提供的臨界控制值一致,以保證對(duì)于同一種樣本能有部分陽性,部分陰性的結(jié)果。每種代表性食品的測(cè)試樣品數(shù)應(yīng)達(dá)20以上,以滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算要求;采用ELISA試劑盒方法和參考方法進(jìn)行同步檢測(cè),按下表進(jìn)行計(jì)算。
表1 ELISA試劑盒方法和參考方法的檢測(cè)結(jié)果表示[8]
注:N是所有樣品數(shù)的總和(NA+PA+PD+ND);N-是參考方法獲得的陰性結(jié)果數(shù)(NA+PD);N+是參考方法獲得的陽性結(jié)果數(shù)(PA+ND)。
4.2相對(duì)檢測(cè)水平、與參考方法的一致性
根據(jù)ELISA試劑盒的驗(yàn)證要求,選取合適的驗(yàn)證菌株和食品種類,盡可能使每種菌伴隨一種食品類別。針對(duì)每種食品中的一個(gè)目標(biāo)菌至少檢測(cè)其3個(gè)水平:第1個(gè)水平可以是陰性對(duì)照,第2個(gè)水平應(yīng)是理論上的檢測(cè)限,第3個(gè)水平稍高于理論檢測(cè)閾值。利用ELISA試劑盒方法和參考方法對(duì)每種組合(食品類型、污染水平)都重復(fù)檢測(cè)至少6次。
對(duì)每個(gè)水平和每種食物/菌株組合,可按表2所示采用Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行比較。
不僅可比較ELISA試劑盒方法同參考方法用于同一食品/菌株中同一接種水平檢測(cè)時(shí)有無差異,而且可比較相同接種水平的兩種不同食品/菌株組合的檢測(cè)結(jié)果。相對(duì)檢測(cè)水平則可用檢出率剛好超過50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品污染水平來表示。
表2 相對(duì)檢測(cè)水平的計(jì)算[8]
4.3包容性和排他性
根據(jù)ELISA試劑盒的測(cè)定范圍選擇合適的目標(biāo)菌50株,另從可能對(duì)目標(biāo)菌檢測(cè)造成干擾和所驗(yàn)證食品中出現(xiàn)概率高的菌株中選擇非目標(biāo)菌至少30株。目標(biāo)菌的檢測(cè)水平要比ELISA試劑盒的相對(duì)檢測(cè)水平高10至100倍,非目標(biāo)菌的檢測(cè)水平應(yīng)與所驗(yàn)證食品中可能出現(xiàn)的最高污染水平相當(dāng)。利用ELISA試劑盒和參考方法對(duì)上述菌株的純培養(yǎng)物進(jìn)行同步檢測(cè),比較ELISA試劑盒的包容性和排他性。
除了上述主要指標(biāo),對(duì)定量檢測(cè)用ELISA試劑盒還應(yīng)評(píng)價(jià)其檢測(cè)范圍、檢測(cè)限、定量限、回收率等指標(biāo),具體計(jì)算亦可參考ISO或其他官方驗(yàn)證方法[6,8]。同時(shí),在試驗(yàn)設(shè)計(jì)上同樣應(yīng)注重對(duì)試驗(yàn)樣本的選擇,細(xì)致地劃分檢測(cè)樣本的類型,從而使得對(duì)ELISA試劑盒的評(píng)價(jià)更具科學(xué)性。
ELISA試劑盒在我國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景,其質(zhì)量把關(guān)是保障檢測(cè)結(jié)果的可靠性、可比性和權(quán)威性的重要前提,尤其對(duì)于“憑技術(shù)執(zhí)法、靠數(shù)據(jù)說話”的檢驗(yàn)檢疫工作而言更是有著舉足輕重的作用。建立科學(xué)規(guī)范的ELISA檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)體系,加強(qiáng)使用過程中的質(zhì)量控制,可有助于提高我國(guó)檢驗(yàn)檢疫實(shí)驗(yàn)室的競(jìng)爭(zhēng)力,提升政府信任度,促進(jìn)檢測(cè)結(jié)果的國(guó)際互認(rèn),沖破國(guó)外技術(shù)壁壘,樹立我國(guó)的地位和形象,推動(dòng)進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展。
[1]Engvall E,Perlmann P.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)[J].Quantitative assay of immunoglobulin G Immunochemistry,1971,8(9):871-874.
[2]農(nóng)業(yè)部.關(guān)于加強(qiáng)獸藥殘留檢測(cè)試劑(盒)管理的通知[Z].農(nóng)辦醫(yī)[2005]3號(hào),2005.
[3]農(nóng)業(yè)部.關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案審查技術(shù)資料要求》和《獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑(盒)備案參考評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)》的通知[Z].農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號(hào),2005.
[4]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法(試行)的通知[Z].國(guó)食藥監(jiān)械[2007]229號(hào),2007.
[5]國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法[Z].國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào),2014.
[6]SN/T 2775-2011商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法[S].
[7]畢勝利.ELISA檢測(cè)試劑的評(píng)價(jià)方法[D].北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2006.
[8]ISO 16140:2003(E)Microbiology of food and animal feeding stuffs-Protocol for the validation of alternative methods[S].
[9]Appendix M:Validation Procedures for Quantitative Food Allergen ELISA Methods:Community Guidance and Best Practices.Official Methods of Analysis,19th Ed.,2012,AOAC INTERNATIONAL,Gaithersburg,MD.
Application and Quality Control of ELISA Detection Kit in Entry-Exit Inspection and Quarantine
Wei Haiyan,Zeng Jing,Zhang Wei,Liu Jianli,Liang Xinmiao,Li Dongyan,Liu Laifu*
(Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing,100026)
This paper introduced the application of ELISA test kit in inspection and quarantine field,the existing problems and the present situation of supervision,and discussed the evaluation method of quality control for ELISA kit.
ELISA;Kit;Inspection and Quarantine;Application;Quality Control
R446.61
E-mail:weihy@bjciq.gov.cn;*通訊作者E-mail:liulf@bjciq.gov.cn
國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013IK306)
2015-06-09