江海強(qiáng)，魏帥帥，吳臘梅，吳 亮，陳盛霞

（1.江陰市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇214400；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

陰道毛滴蟲不同引物PCR檢測結(jié)果比較

江海強(qiáng)1，2，魏帥帥2，吳臘梅2，吳 亮2，陳盛霞2

（1.江陰市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇214400；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的 比較使用不同引物進(jìn)行陰道毛滴蟲PCR的檢出率。方法 分別應(yīng)用3對引物（TVK3-TVK7、BTUB9-BTUB2、TV1-TV2）檢測72例陰道毛滴蟲陽性的陰道分泌物標(biāo)本，比較其檢出率的差異。結(jié)果 引物1檢出率[68.1%（49/72）]與引物2[86.1%（62/72）]比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；引物1、2與引物3檢出率[76.4%（55/72）]比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 引物2具有較高的檢出率，引物的選擇是影響PCR檢出率的重要因素之一。

毛滴蟲，陰道； 聚合酶鏈反應(yīng)； 陰道

陰道毛滴蟲是臨床較為常見的一種寄生蟲，主要寄生于人體的陰道、尿道和前列腺，主要引起婦女的陰道毛滴蟲病。有報道稱，陰道毛滴蟲感染可以使孕婦胎盤破裂、早產(chǎn)、新生兒體質(zhì)量過輕的概率增加[1-3]，陰道毛滴蟲也可引起男性非淋菌性尿道炎、前列腺炎、不育等疾病，最近有研究結(jié)果顯示，陰道毛滴蟲感染增加人類免疫缺陷病毒感染的機(jī)會[4]。陰道毛滴蟲病作為一種常見的性傳播疾病，嚴(yán)重影響著人類的健康。目前，臨床上常規(guī)使用的檢測方法是生理鹽水濕片鏡檢法，其敏感度較低，Pattullo等[5]對345名婦女的陰道標(biāo)本用濕片法進(jìn)行檢測，其敏感度為58.5%。

PCR是一種廣泛使用的檢測技術(shù)，目前逐漸被應(yīng)用于陰道毛滴蟲的檢測中。Wendel等[6]用PCR檢測337例女性的陰道分泌物標(biāo)本，其敏感度和特異度分別為84%和94%，明顯高于濕片鏡檢法。本文旨在研究使用不同引物進(jìn)行PCR時，其陰道毛滴蟲檢出率的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑 全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國SynGene公司），SG-20干式恒溫儀（金壇市虹盛儀器廠），超低溫冰箱（Thermo公司），超凈工作臺（蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司），梯度PCR儀（德國Eppendorf公司），垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司），低溫高速離心機(jī)（德國Heraeus公司），電子天平（賽多利斯北京有限公司），PCR預(yù)混液（美國promega公司），瓊脂糖（Speeifieations公司），酚氯仿（南京諾唯贊公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本來源 收集婦科門診陰道毛滴蟲濕片鏡檢法為陽性的陰道分泌物標(biāo)本72例，3 000 r/min離心10min，棄去上清液，取其沉渣，保存于-70℃低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 PCR標(biāo)本的前處理 將保存于-70℃的標(biāo)本放于室溫復(fù)融，加入300 μL的1×PBS（pH7.4），顛倒混勻，3 000 r/min，離心10 min，棄其上清液，得細(xì)胞沉淀。再次加入300 μL的1×PBS，顛倒混勻，3 000 r/min，離心10 min，棄其上清液，得細(xì)胞沉淀。

1.2.2 酚氯仿法提取陰道毛滴蟲DNA 步驟如下：（1）在上述處理后的標(biāo)本中分別加入三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）500 μL、RNAse（10 mg/μL）1 μL、10%十二烷基硫酸鈉（SDS）10 μL、蛋白酶 K（20 mg/μL）20 μL，55℃裂解10 min。（2）加入500 μL酚氯仿，顛倒混勻數(shù)次，12 000 r/min離心，吸取上層水相400 μL于另一EP管中。（3）向EP管中加入40 μL的3 mol/L醋酸鈉和1 000 μL冰無水乙醇，置于-20℃冰箱中20 min，沉淀DNA。（4）用低溫高速離心機(jī)以4℃最高速離心10min，棄上清液，加入1 000 μL 75%乙醇洗滌。（5）以4℃最高速離心10 min，吸棄可見的乙醇液滴，置于37℃中干燥。（6）待乙醇揮發(fā)充分后，將沉淀溶于50 μL的TE中。

1.2.3 PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中陰道毛滴蟲標(biāo)準(zhǔn)株基因組的基因序列，在保證開放閱讀框正確的前提下，參照文獻(xiàn)[7-9]合成3對引物（表1），所有引物與NCBI數(shù)據(jù)庫比對確認(rèn)正確后，送至上海生物工程有限公司進(jìn)行合成。

表1 3對引物序列

1.2.4 PCR的反應(yīng)擴(kuò)增體系 總反應(yīng)體系25 μL，包括PCR Green Mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1μL，模板DNA 4 μL，滅菌蒸餾水6.5 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性10 min，94℃1 min，（55±5）℃20 s，72℃30 s。設(shè)置退火溫度為55℃，上下5℃，摸索陰道毛滴蟲PCR的最佳退火溫度，總共反應(yīng)35個循環(huán)后，72℃延伸10min使反應(yīng)完全。擴(kuò)增完成后，取5 μL的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，將凝膠于凝膠圖像分析儀下觀察并拍照。同時，選取最佳退火溫度對所有標(biāo)本進(jìn)行PCR。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR條件的優(yōu)化結(jié)果 梯度PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后檢測10個溫度下3對引物擴(kuò)增效率，結(jié)果顯示，10個退火溫度下均能擴(kuò)增出單一條帶，大小分別為300、120、312 bp，與預(yù)期大小一致（圖1、2、3）。本研究選取55℃作為最佳退火溫度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 引物1梯度PCR結(jié)果

圖2 引物2梯度PCR結(jié)果

圖3 引物3梯度PCR結(jié)果

2.2 PCR檢測陰道毛滴蟲結(jié)果 3對引物對所有用堿裂解法提取的DNA標(biāo)本進(jìn)行PCR，反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4、5、6。

圖4 1～12號標(biāo)本引物1 PCR結(jié)果

圖5 1～12號標(biāo)本引物1 PCR結(jié)果

圖6 1～12號標(biāo)本引物3 PCR結(jié)果

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果 72例陽性標(biāo)本中引物1陽性49例，檢出率為68.1%；引物2陽性62例，檢出率為86.1%；引物3陽性55例，檢出率為76.4%。引物1與引物2檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；引物1、2與引物3比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

近年來，人們對泌尿生殖系統(tǒng)感染病原體的研究日益深入，陰道毛滴蟲作為一種人體常見的寄生蟲越來越受到人們的重視。陰道毛滴蟲不僅能引起女性陰道炎，還能引起不育和許多圍生期并發(fā)癥。最近有研究顯示，陰道毛滴蟲感染與人類免疫缺陷病毒感染和宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。

目前，我國臨床所使用的陰道毛滴蟲檢測方法主要是濕片鏡檢法，該法與培養(yǎng)法相比，其敏感度和特異度都比較低，而且很容易受到標(biāo)本保存和運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)前處理及檢驗(yàn)者操作經(jīng)驗(yàn)等諸多因素的影響，容易引起漏診和誤診。因此，有學(xué)者認(rèn)為，陰道毛滴蟲檢測不能以濕片鏡檢法作為確診試驗(yàn)[10]。PCR作為一種常用的分子生物學(xué)檢測方法，已逐漸被用于陰道毛滴蟲檢測中。

在PCR技術(shù)臨床運(yùn)用中，引物的選擇是關(guān)鍵因素，其直接關(guān)系到檢測的靈敏度和特異度。在此次研究中，以酚氯仿法提取的DNA為模板，分別用3對引物擴(kuò)增，其陽性率分別是68.1%、86.1%和76.4%，引物2 PCR的檢出率較高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCR引物的設(shè)計直接關(guān)系到標(biāo)本的陽性檢出率，所以PCR實(shí)驗(yàn)引物的選擇優(yōu)化非常重要。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.22.033

B

1009-5519（2015）22-3448-03

2015-09-06）

江海強(qiáng)（1979-），男，江蘇江陰人，碩士研究生，主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作；E-mail：573312027@qq.com。