周云麗 王萌 仝穎娜 劉曉彬 董冬 邵潔

·臨床研究與應(yīng)用·

乳腺癌中神經(jīng)激肽受體的表達及受體拮抗劑的作用研究*

周云麗 王萌 仝穎娜 劉曉彬 董冬 邵潔

目的：研究乳腺癌中全長型、截短型神經(jīng)激肽1受體（neurokinin 1 receptor，NK1R）和神經(jīng)激肽2受體（neurokinin 2 re?ceptor，NK2R）的表達，及受體拮抗劑對乳腺癌細胞生長的影響。方法：采用免疫組織化學(xué)法檢測天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院51例乳腺癌及其癌旁正常組織、30例乳腺良性病變組織總NK1R（包括NK1R-FL和NK1R-Tr）和NK2R表達，采用實時定量PCR和免疫印跡技術(shù)檢測乳腺細胞系中NK1R-FL、NK1R-Tr和NK2R表達，建立NK1R-FL和NK1R-Tr過表達的乳腺細胞系,在NK1R和NK2R拮抗劑作用下測定細胞增殖和軟瓊脂集落形成能力。結(jié)果：乳腺癌及癌旁正常組織、乳腺良性病變組織中均總NK1R過表達，乳腺癌組織中NK1R-FL、NK2R表達相比癌旁正常組織顯著降低，并與乳腺癌分型、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ki-67、HER-2、ER和PR表達相關(guān)。HBL-100細胞中NK1R-FL和NK2R過表達、NK1R-Tr低表達，MDA-MB-231、T-47D和MCF-7細胞中只表達NK1R-Tr。乳腺癌細胞中NK1R-Tr低表達、NK1R-FL表達增加其對NK1R和NK2R受體拮抗劑的敏感度。結(jié)論：乳腺組織中NK1R-FL、NK2R共表達，乳腺癌細胞中NK1R-Tr過表達并負反饋調(diào)節(jié)NK1R-FL和NK2R的表達，NK1R和NK2R受體可能成為乳腺癌治療的新靶標。

乳腺癌 神經(jīng)激肽1受體 神經(jīng)激肽2受體 拮抗劑

速激肽是C末端有-Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2共同結(jié)構(gòu)肽的總稱［1］。哺乳動物的速激肽主要包括P物質(zhì)（substance P，SP）、神經(jīng)激肽A（neurokinin A，NKA）、神經(jīng)激肽B（neurokinin B，NKB）等。速激肽通過與其受體相結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，速激肽受體分為NK1R-SP、NK2R-NKA、NK3R-NKB三種敏感類型。NK1R廣泛分布于中樞和外周組織，NK2R主要存在于外周組織。人NK1R基因由5個外顯子組成，目前在人體組織中的mRNA和蛋白水平上所發(fā)現(xiàn)的NK1R變異體只有全長型受體（NK1R-full length，NK1R-FL）和C-末端缺乏96個氨基酸殘基的截短型受體（NK1R-truncted，NK1RTr）［2-3］。SP能夠以直接和間接等多種方式參與腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移，研究顯示這一促腫瘤特性是通過與NK1R-Tr而非NK1R-FL的相互作用實現(xiàn)的［4-5］。NK2R在結(jié)腸等組織中與NK1R共表達，并在腫瘤細胞中顯示出了相反的作用［6］。本研究目的一是檢測乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中NK1R、NK1R-FL、NK1R-Tr和NK2R的表達；二是通過將克隆的NK1R-FL和NK1RTr基因分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和非腫瘤源性的乳腺細胞系，評價NK1R和NK2R受體拮抗劑對乳腺癌細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 51例乳腺癌及癌旁正常組織、30例乳腺良性病變組織來源于天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院術(shù)后患者，其臨床病理資料見本課題組前期研究［7］。

1.1.2 細胞 MDA-MB-231為高轉(zhuǎn)移性的乳腺癌細胞系，T47D和MCF-7為ER陽性的乳腺癌細胞系，SK-BR-3為HER-2陽性的乳腺癌細胞系，HBL-100為非腫瘤源性的乳腺上皮細胞系，均為天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心實驗室保存。

1.1.3 試劑 兔NK1R的N-末端多克隆抗體購自美國Novus公司；SP、NK2R受體拮抗劑L-117、β-actin單克隆抗體和NK1R的C-末端多克隆抗體均購自美國Sigma-Aldrich公司；兔二步法檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠和抗兔的HRP標記的IgG購自英國Upstate公司；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自英國KPL公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclon公司；NK1R受體拮抗劑ASN-1377642購自德國Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測 NK2R的檢測材料、方法、結(jié)果判斷與前期的NK1R和NK1R-FL研究相同［7］，NK2R特異性一抗工作濃度為1∶200。

1.2.2 過表達穩(wěn)定株的建立和細胞培養(yǎng) MDAMB-231細胞中的NK1R-FL和HBL-100細胞中的NK1R-Tr過表達穩(wěn)定株建立的方法參見本課題前期研究［7］。所有細胞采用DMEM/F12培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 實時定量PCR PCR擴增條件為95℃15 s、51～58℃（根據(jù)各基因不同）15 s、72℃ 45 s，共進行40個循環(huán)，PCR引物見表1。目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCt法，其中-ΔΔCt=ΔCt（標準基因）-ΔCt（目的基因）。

1.2.4 Western blot檢 測 NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R蛋白表達的方法參見本課題前期研究［7］。

1.2.5 細胞增殖作用的檢測 檢測NK1R和NK2R受體拮抗劑對乳腺癌細胞增殖作用。將對數(shù)生長期MDA-MB-231（野生型組）、空載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231-C2細胞（空載體對照組），MDA-MB-231-NK1RFL穩(wěn)定過表達細胞，HBL-100（野生型組）、空載體轉(zhuǎn)染HBL-100-C2（空載體對照組）細胞及HBL-100-NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中孵育24 h，每孔分別加入NK1R或NK2R受體拮抗劑，使其終濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0μmol/L，作用5min后加入1×10-7mol/L的SP培養(yǎng)48 h。每孔加入MTS工作液，孵育2 h，492 nm處檢測OD值，計算細胞生長抑制率。生長抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.6 軟瓊脂集落形成實驗 取MDA-MB-231-NK1R-FL、HBL-100-NK1R-Tr及其野生型和空載體對照細胞，使NK1R和NK2R受體拮抗劑在細胞培養(yǎng)液中的終濃度均為15μmol/L，預(yù)處理5min后加入1×10-7mol/L的SP。將細胞均勻滴加到已用細胞培養(yǎng)液制備的終濃度為0.5%受體拮抗劑底層瓊脂糖凝膠上，培養(yǎng)15天后倒置顯微鏡下計數(shù)上下左右中5個不同視野下50個以上的細胞集落形成數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較用Student-Newman-Keuls法，臨床病理變量和NK1R的分析采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 實時定量PCR引物Table1 Real-timequantitative PCR primers

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌、癌旁正常組織及乳腺良性病變組織中總NK1R、NK1R-FL和NK2R的表達

NK1R的N-末端抗體檢測總NK1R（包括NK1RFL和NK1R-Tr）表達，NK1R的C-末端抗體檢測NK1R-FL表達，考慮因NK1R-Tr表達差異造成。結(jié)果顯示乳腺癌、癌旁正常組織及乳腺良性病變組織中總NK1R表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且總NK1R表達與乳腺癌分型、組織學(xué)分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及ER、PR、HER-2、Ki-67等臨床病理因素均無關(guān)。乳腺癌組織中NK1R-FL和NK2R的表達較癌旁正常組織顯著降低，其中浸潤性導(dǎo)管癌下降較為顯著；NK1R-FL和NK2R的表達隨組織學(xué)分級升高而逐漸降低；NK1R-FL和NK2R表達的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者均低于無轉(zhuǎn)移者；NK1R-FL和NK2R表達的ER和PR陰性者顯著低于陽性者；NK1R-FL和NK2R表達的Ki-67、HER-2陰性者顯著高于陽性者。雖然NK2R表達情況與NK1R-FL相似，但在大多數(shù)的樣本中表達低于NK1R-FL（圖1，表2）。

2.2 不同乳腺細胞系中NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R的mRNA和蛋白表達

乳腺細胞系中 NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R 的mRNA和蛋白測定顯示：HBL-100細胞中NK1R-FL和NK2R的mRNA和蛋白相對高表達；MDA-MB-231、T-47D和MCF-7細胞中僅NK1R-Tr的mRNA和蛋白表達（圖2）。

2.3 NK1R-FL或NK1R-Tr穩(wěn)定過表達對MDA-MB-231和HBL-100細胞中NK2R的蛋白表達影響

與未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細胞相比，MDA-MB-231-NK1R-FL穩(wěn)定過表達細胞中NK2R的蛋白表達明顯升高，NK1R-FL過表達上調(diào)NK2R表達；與未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的HBL-100細胞相比，HBL-100-NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞中NK2R的蛋白表達明顯下降，NK1R-Tr過表達下調(diào)NK2R表達（圖3）。

2.4 受體拮抗劑對NK1R-FL或NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞增殖的影響

NK1R受體拮抗劑隨濃度升高抑制MDA-MB-231-NK1R-FL穩(wěn)定過表達細胞在體外的增殖，不同濃度下的抑制率均高于野生型和空載體對照組；HBL-100-NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞隨濃度升高抑制率升高，但不同濃度下的抑制率均低于野生型和空載體對照組。NK2R受體拮抗劑隨濃度升高抑制MDA-MB-231-NK1R-FL穩(wěn)定過表達細胞在體外的增殖，不同濃度下的抑制率與野生型和空載體對照組比較均升高，但在低濃度下具有顯著性差異；HBL-100-NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞隨濃度升高抑制率升高，但不同濃度下的抑制率均低于野生型和空載體對照組（圖4）。

2.5 受體拮抗劑對NK1R-FL或NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞軟瓊脂集落形成的影響

MDA-MB-231-NK1R-FL穩(wěn)定過表達細胞在無拮抗劑、NK1R和NK2R受體拮抗劑條件下，軟瓊脂集落形成能力均顯著低于野生型和空載體對照組；HBL-100-NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞在無拮抗劑條件下軟瓊脂集落形成能力高于野生型和空載體對照組，而NK1R和NK2R受體拮抗劑條件下集落形成能力則均顯著高于野生型和空載體對照組（圖5）。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測乳腺組織中總NK1R、NK1R-FL和NK2R表達（SP×100）Figure l TotalNK1R,NK1R-FL,and NK2R expression in breast tissuesdetected with immunohistochemistry（SP×100）

表2 乳腺組織中總NK1R、NK1R-FL和NK2R 表達Table 2 Total NK1R, NK1R-FL, and NK2R expression levels in breast tissues

圖2 乳腺細胞系中NK1R-FL、NK1R-Tr、NK2R的mRNA和蛋白表達Figure2 Detection ofNK1R-FL,NK1R-Tr,and NK2RmRNA and protein expression levels in breastcell lines

圖3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NK1R-FL或NK1R-Tr的乳腺細胞中NK1R-FL、NK1R-Tr和NK2R的蛋白表達Figure 3 NK2R,NK1R-FL,and NK1R-Tr protein expression in breastcell linesstably transfected with NK1R-FL or NK1R-Tr

圖4 受體拮抗劑對NK1R-FL或NK1R-Tr穩(wěn)定過表達細胞增殖的影響Figure4 Effectof receptorantagoniston the proliferation ofcellsstably transfectedwith NK1R-FL/NK1R-Tr

3 討論

速激肽受體屬于跨膜7次的G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptors，GPCR），在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中作為興奮型的神經(jīng)遞質(zhì)引起高血壓、血管平滑肌收縮、增加血管滲透性、參與免疫和炎癥應(yīng)答、刺激內(nèi)分泌和外分泌腺分泌［8-10］。目前已有研究證實，GPCR在乳腺癌［11］等多種疾病中表達異常。NK1R-FL和NK1R-Tr兩種受體由于其胞內(nèi)段的不同，具有不同的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特點，相較于NK1RFL伴隨著G蛋白偶聯(lián)功能的下降，NK1R-Tr與其配體SP的親和性下降了近十倍，受體失去內(nèi)化和脫敏的自分泌調(diào)節(jié)，延長了與配體的作用時間，因此在乳腺癌的進展中兩種形式的NK1R可能起著不同的作用。本研究結(jié)果顯示，隨著乳腺癌的進展，乳腺癌組織中NK1R-FL和NK2R的表達逐漸降低，而NK1RTr表達則逐漸升高；NK1R-FL和NK2R在正常乳腺組織中呈共表達，在乳腺癌的進展中NK1R-FL、NK2R與NK1R-Tr可能存在負反饋調(diào)節(jié)關(guān)系。實時定量PCR和免疫印跡法表達結(jié)果印證了MDA-MB-231細胞中NK1R-FL表達上調(diào)NK2R的mRNA和蛋白表達；而HBL-100細胞中NK1R-Tr過表達則下調(diào)NK2R表達，進一步表明乳腺細胞中NK1R-FL、NK2R與NK1R-Tr可能存在負反饋調(diào)節(jié)關(guān)系。

速激肽受體在健康和疾病狀態(tài)下的功能特點顯示其可作為新藥物的重要靶標［12-13］。SP結(jié)合NK1R后調(diào)控與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程，如細胞生長增殖、血管生成、腫瘤的遷移和侵襲等。應(yīng)用NK1R拮抗劑，可特異性抑制腫瘤細胞增殖、移動和血管生成［14-15］。本研究使用拮抗劑分析NK1R-FL、NK1R-Tr兩種同工型與NK2R表達關(guān)系顯示，NK1R-FL過表達抑制MDA-MB-231細胞的增殖，而NK1R-Tr過表達則增強HBL-100細胞的增殖。NK1R受體拮抗劑隨藥物濃度的升高及作用時間的延長抑制NK1R-FL過表達的MDA-MB-231和HBL-100細胞在體外的增殖和集落形成能力，并隨濃度升高抑制NK1R-Tr過表達的HBL-100細胞的增殖和集落形成能力；NK2R受體拮抗劑隨濃度升高抑制NK1R-FL過表達的MDAMB-231和HBL-100細胞在體外的增殖和集落形成能力。研究結(jié)果進一步顯示，乳腺癌細胞中NK1RTr的表達上調(diào)可能造成NK1R-FL和NK2R的表達下調(diào)，降低NK1R、NK2R受體拮抗劑對乳腺癌細胞的作用，但NK1R和NK2R受體拮抗劑均可抑制乳腺癌細胞的生長。

本研究初步揭示了乳腺癌細胞中NK1R-FL、NK2R與NK1R-Tr的負反饋調(diào)節(jié)關(guān)系，為進一步了解三者之間的調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。NK1R、NK2R受體可能成為乳腺癌治療的新靶點。

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（2015-10-12收稿）

（2015-12-07修回）

Expression of neurokinin receptors and the effect of their antagonistson human breast cancer

YunliZHOU,MengWANG,Yingna TONG,Xiaobin LIU,Dong DONG,Jie SHAO

YunliZHOU;E-mail:zhouyunli@tjmuch.com
Department of Clinical Laboratory,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital,National Clinical Research Center for Cancer,Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin 300060,China
Thisworkwassupported by the NationalNaturalScience Foundation of China(No.81201653)

Objective:To determ ine the expression of the full-length(NK1R-FL)and truncated(NK1R-Tr)neurokinin-1 receptor(NK1R)and the neurokinin-2 receptor(NK2R)in breast cancer tissues and cell lines,aswell as to study the effects of the NK1R and NK2R antagonists on the grow th of breast cancer cells.Methods:Immunohistochem istry and Western blotassayswere used to detect NK1R,NK1R-FL,and NK2R expression in clinicalsamples of primary breast cancer tissue,benign lesions,and normalbreast tissue,as wellas in differentbreast cancer cell lines.Cell proliferation and softagar grow th testswere performed on cells treated w ith the NK1R and NK2R antagonists to study the ectopic overexpression of NK1R-FL and NK1R-Tr in breast cancer cell lines.Results:Total NK1R expression was detected in the breast cancer tissues,benign lesions,and normalbreast tissues.Compared w ith the normalbreastepithelia and benign breast lesions,the expression levels of NK1R-FL and NK2R decreased in the carcinoma.These changeswere also related to the carcinoma type,histologicalgrade,lymph nodemetastasis,HER2 and Ki-67 expression,and estrogen and progesterone receptors in breast cancer.The expression levels of NK1R-FL and NK2R were high in the HBL-100 breast cell lines of para-neoplastic tissues,butNK1R-Trexpressionwas low.TheMDA-MB-231,T-47D,and MCF-7 cellsonly expressed NK1R-Tr.NK1R-Tr or NK1R-FL overexpression caused the decreased inhibition rate or increased levels of the NK1R and NK2R antagonists in the breast cancer cells.Conclusion:NK1R-FL and NK2R are co-expressed in normal cells.NK1R-Tr ishighly expressed in breastcancer cellsand exertsnegative feedback to regulate NK1R-FL and NK2R expression in all cells,especially cancer cells.

breastcancer,neurokinin 1 receptor,neurokinin 2 receptor,antagonist

10.3969/j.issn.1000-8179.2015.24.112

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室（天津市300060）

*本文課題受國家自然科學(xué)基金項目（編號：81201653）資助

周云麗 zhouyun li@tjm uch.com

周云麗 專業(yè)方向為腫瘤的神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫相關(guān)分子研究。

E-mail：zhouyunli@tjmuch.com