王 兵 張林吉 康永剛（徐州生物工程職業(yè)技術學院 江蘇 徐州 221006）

羊支原體性肺炎(MPSG)是由支原體所引起的一種高度接觸性傳染病，其臨床特征為咳嗽、高熱、漸進性消瘦，肺、胸和胸膜發(fā)生漿液性、纖維素性炎癥為主要特征，取急性和慢性經(jīng)過，病死率很高。徐州及其周邊地區(qū)的養(yǎng)羊業(yè)在蓬勃發(fā)展，同時疫病時有發(fā)生，特別是羊支原體性肺炎對養(yǎng)羊業(yè)危害較大。2014年11月份，徐州豐縣羊養(yǎng)殖戶送來幾只死羊，主述最近整群精神萎靡、消瘦、流鼻涕、有咳嗽、稀瀉。發(fā)病率90%以上，死亡率22.3%，且每天不斷有大量新死亡病例，用了大量的藥物控制不住，尋求本院幫忙。

1 臨床癥狀

羊群發(fā)病羊體溫達41～42℃，病死羊眼角濕潤，有些膿性分泌物，眼眶凹陷，口腔發(fā)生潰瘍，皮毛干燥，肛門及附近毛被糞便污染。

2 病理變化

解剖檢查：胸部肌肉紅白相間，胸腔少量積液，一側(cè)肺已經(jīng)和肋骨發(fā)生粘連，同側(cè)肺和膈肌也發(fā)生粘連，支氣管與縱膈淋巴結(jié)充血、腫大。心包渾濁，附有大量纖維素樣滲出物，肺嚴重淤血，肝上也有一薄層纖維素樣滲出物包裹，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，膽囊異常腫大，腎臟皮質(zhì)出血，腎被膜發(fā)生粘連，不易剝離，結(jié)腸出血。

3 實驗室診斷

3.1 培養(yǎng)基 支原體肉湯培養(yǎng)基、支原體瓊脂培養(yǎng)基、馬血清，均購自青島海博生物技術有限公司，青霉素、常用染色液由徐州生物工程職業(yè)技術學院動物微生物實驗室提供。

3.2 病料采集 無菌采集羊肺部病健交界處肺組織、肝臟組織，用無菌注射器抽取心包積液和胸腔積液。隨即進行實驗室病原分離培養(yǎng)。肝臟和肺臟組織樣品、心包積液和胸腔積液樣品的處理方法如下：用滅菌手術刀剔除肝臟和肺臟病料表面組織，取1cm3左右深層組織塊，剪碎后加少量的支原體肉湯培養(yǎng)基研磨成乳劑，再將組織液分裝于1.5ml的EP管中，2000r/min離心3～5min，取離心后上清以1:10比例接種于支原體肉湯培養(yǎng)基中，另取0.4ml上清液均勾涂布于支原體瓊脂培養(yǎng)基平板上；心包積液和胸腔積液用0.45μm細菌過濾器過濾除菌后的濾液以1:10比例接種于支原體肉湯培養(yǎng)基中，另取0.4ml上清液均勾涂布于支原體瓊脂培養(yǎng)基平板上。

3.3 支原體培養(yǎng) 接種的支原體肉湯培養(yǎng)基和支原體瓊脂培養(yǎng)基在5%CO2、一定濕度和37℃下培養(yǎng)7～12d。每隔24h觀察一次，如果發(fā)生污染，應及時用0.22μm的無菌濾器過濾后繼續(xù)培養(yǎng)。將液體培養(yǎng)基顏色變黃的液體培養(yǎng)物盲傳三代，再接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)和純化；在光學顯微鏡下觀察固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)物的菌落形態(tài)，選取具有支原體菌落形態(tài)特征的單個菌落，用接種環(huán)挑取放入液體培養(yǎng)基中純化和傳代。重復該步驟3～5次，得到的支原體單菌落培養(yǎng)物。

3.4 形態(tài)學鑒定（1）用低倍光學顯微鏡觀察純化三代以上的疑似羊支原體在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。（2）用培養(yǎng)3～5d的液體培養(yǎng)物玻板涂片，甲醇固定，姬姆薩染色3～5h，在光學顯微鏡下觀察分離菌株菌體形態(tài)。

3.5 生理生化鑒定 參照陸承平(2001)提供的方法分別進行水解精氨酸試驗、尿素分解試驗、發(fā)酵葡萄糖試驗、美藍還原試驗、菌落吸附紅細胞試驗。操作如下：（1）水解精氨酸試驗：在支原體液體培養(yǎng)基加人10%葡萄糖，將pH調(diào)至7.6，分裝于試管中。取液體培養(yǎng)物1.5ml接種于培養(yǎng)基中，設陰性對照管。37℃培養(yǎng)6～10d，試管顏色從紫紅色變成黃色，pH值下降0.5單位以上，而對照管不變色時為陽性，二者均不變色為陰性。（2）分解尿素試驗：在支原體液體培養(yǎng)基中加入10%尿素，將pH調(diào)至7.0，取液體培養(yǎng)物1.5ml接種于培養(yǎng)基中，設陰性對照管。37℃下培養(yǎng)5周。試驗管從黃色變?yōu)榧t色而對照管不變色時為陽性，二者均不變色則為陰性。（3）發(fā)酵葡萄糖試驗：在支原體液體培養(yǎng)基中加人10%的精氨酸， 將pH調(diào)至7.0，分裝后接種，設陰性對照管。37℃培養(yǎng)6～10d，試驗管顏色從黃紅色變成紫紅色，pH值上升0.5單位以上，而對照管不變色時為陽性，二者均不變色則為陰性。（4）美藍還原試驗：在支原體液體培養(yǎng)基中加0.1%美藍溶液0.025ml，接種液體培養(yǎng)物0.5ml，設陰性對照管。37℃培養(yǎng)7～10d，觀察試管顏色的變化。顏色變淺的為陽性，不變色的為陰性。（5）菌落吸附紅細胞試驗：將液體培養(yǎng)物Iml接種到固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)6～7d后，在40倍光鏡下檢查菌落生長情況。在生長菌落的固體培養(yǎng)基表面，加入2ml0.25%雞紅細胞生理鹽水懸液，室溫作用而20min，棄去紅細胞懸液，用生理鹽水洗滌3～5次，在低倍鏡下觀察，菌落表面布滿紅細胞者為陽性，無紅細胞者為陰性。

4 結(jié)果

4.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 在病死羊體內(nèi)共分離到2株疑似羊肺炎支原體菌株。2株均分離自病羊肺臟。

4.2 形態(tài)觀察結(jié)果 純化菌落顯微鏡觀察，10倍物鏡下可見具明顯中心臍，邊緣整齊，光滑。

4.3 生化鑒定結(jié)果 生化鑒定結(jié)果與相關文獻報道的基本一致。能發(fā)酵葡萄糖、還原美蘭，不分解尿素、不水解精氨酸、菌落不吸附0.25%的雞紅細胞。結(jié)果見附表：

附表 生化鑒定結(jié)果

4 小結(jié)

（1）秋末、冬末和春初由于氣溫驟變，養(yǎng)殖密度較高的、尤其是圈養(yǎng)的羊群中，本病較易發(fā)生和流行。（2）該病呈地方性流行，病羊是主要的傳染源，飛沫傳播是其主要傳染方式，新疫區(qū)的爆發(fā)多是由于未經(jīng)檢疫的病羊的引進而發(fā)生的。該病傳播速度較快，20d就可波及全群。冬季流行期平均20d，夏季在2個月以上。（3）發(fā)生病變的肺臟組織病原分離率比較高，病料的質(zhì)量對羊支原體性肺炎的病原體的分離成功與否有重要影響。（4）本病常繼發(fā)羊口瘡性潰瘍等其他疫病，所以對于新購羊務必進行隔離觀察后再混群。本研究為徐州地區(qū)羊支原體肺炎耐藥性研究奠定基礎。

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