解瑞欽 趙文東（山東大寶養(yǎng)殖加工有限責(zé)任公司 山東 新泰 271200）

干擾素(interferon，IFN)是在特定的誘生劑作用下，由細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有高度生物活性的糖蛋白，在同種動(dòng)物細(xì)胞上具有廣譜抗病毒活性，除此之外還有免疫調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞分裂和抗腫瘤等生物學(xué)活性。根據(jù)IFN蛋白的氨基酸序列、細(xì)胞來源以及其所結(jié)合受體的不同，將其分為Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，I型IFN是，主要是α-干擾素和β-干擾素兩種，具有抗病毒的活性，Ⅱ型IFN主要是γ-干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)，除具有I型IFN抗病毒活性外，還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能和抗腫瘤作用。由于IFN-γ對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有極大的調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體發(fā)揮免疫功能，清除體內(nèi)病原體不可缺少的成分，因此，IFN-γ在疾病的診斷、治療和疫苗免疫效果檢測等方面起著重大作用，是現(xiàn)代分子生物學(xué)，免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。

1 材料和方法

DNA，利用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，M13上游引物5’-CG CCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，下游引物5’-AGC GGATAACAATTTCACACAGGA-3’。

1.4 重組蛋白鑒定 將重組病毒感染sf9細(xì)胞，收集感染細(xì)胞進(jìn)行IFA分析，鑒定重組蛋白的表達(dá)。

1.5 重組IFN抗病毒活性分析 利用水泡性口炎病毒(VSV)－鴨胚成纖維細(xì)胞分析重組IFN的抗病毒活性，確定重組IFN的抗病毒活性單位。

2 結(jié)果

2.1 基因擴(kuò)增及序列 PCR擴(kuò)增DIFN-γ蛋白基因片段，取2μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，可見到466bp的條帶(圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

1.1 基因擴(kuò)增及序列分析 根據(jù)已發(fā)表鴨IFN-γ序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增一對(duì)引物，引物序列為：F：5’ATGATCTACGAAT TCCACACCGCCTCC3’；R：5’CAAGTCTGTCGACATA GCAGTTGCAGC3’。分離鴨脾淋巴細(xì)胞，刺激后，提取mRNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將目的產(chǎn)物回收后，連接至pMD-18T載體，測定序列，與已發(fā)表序列進(jìn)行分析。

1.2 重組Bacmid質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 將鴨IFN-γ完整開放閱讀框克隆至pFastbac1載體，鑒定后，轉(zhuǎn)化DH10Bac感受肽細(xì)胞，在三種抗生素的壓力篩選下，獲得整合鴨IFN-γ完整開放閱讀框的重組Bacmid質(zhì)粒。

1.3 重組桿狀病毒的獲得 提取高質(zhì)量的重組Bacmid質(zhì)粒，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，盲傳3代后，提取病毒

2.2 重組Bacmid質(zhì)粒EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切PMDDIFN-γ，將DIFN-γ克隆至供體質(zhì)粒pFastBacTM1EcoRⅠ、SalⅠ位點(diǎn)。將重組供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過Amp+抗性篩選陽性克隆，堿裂解法提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒pFBac-DIFN-γ經(jīng)EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，消化得到約4760bp和550bp兩個(gè)片段(圖2)。

2.3 重組桿狀病毒 從感染重組桿狀病毒的細(xì)胞和培養(yǎng)上清中提取病毒DNA，用M13通用引物進(jìn)行PCR鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為2.8kb(圖3)，結(jié)果表明DIFN-γ基因已通過轉(zhuǎn)座被整合到重組桿狀病毒基因組中，標(biāo)記為rBac-DIFN-γ。

2.4 間接IFA檢測IFN-γ表達(dá) 分別用感染野生型桿狀病毒和rBac-DIFN-γ感染的sf9細(xì)胞制備涂片，以1:100倍稀釋的兔抗原核表達(dá)DIFN-γ免疫血清為一抗，間接IFA檢測重組桿狀病毒表達(dá)的IFN-γ。結(jié)果顯示rBac-DIFN-γ感染細(xì)胞膜上有強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖4A)，而以相同稀釋倍數(shù)的非免疫兔血清為一抗，三種重組桿狀病毒感染細(xì)胞的熒光信號(hào)則為陰性(圖4B)；同樣兔抗原核表達(dá)IFN-γ免疫血清為一抗，野生型桿狀病毒感染細(xì)胞的熒光信號(hào)也為陰性(圖4C)。結(jié)果表明：在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)。

圖4 間接免疫熒光檢測IFN-γ在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)

圖5 利用VSV*GFP－CEF系統(tǒng)測定DIFN-γ抗病毒活性

2.5 重組IFN抗病毒活性 利用VSV*GFP-CEF細(xì)胞病變抑制法測定重組桿狀病毒表達(dá)重組DIFN-γ的抗病毒活性。以不同濃度重組DIFN-γ作用DEF細(xì)胞后，感染VSV*GFP24h后熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，未加重組DIFN-γ空白對(duì)照孔呈現(xiàn)大量熒光(圖5D)；2×104倍稀釋可以完全抑制VSV*GFP在DEF細(xì)胞上的復(fù)制，熒光信號(hào)為陰性(圖5A)；而2×105和2×106倍稀釋部分抑制VSV*GFP的復(fù)制，呈現(xiàn)少量熒光(圖5B,5C)，其活性為2×105IU/ml。

3 討論

（1）本研究構(gòu)建了含有完整IFN-γ基因ORF的重組桿狀病毒，感染昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組IFN-γ，以兔抗原核表達(dá)IFN-γ免疫血清做為一抗，通過間接IFA和間接ELISA檢測其在昆蟲細(xì)胞中獲得表達(dá)。在間接免疫熒光試驗(yàn)檢測IFN-γ表達(dá)時(shí)，熒光主要集中在細(xì)胞膜上，胞漿中熒光相對(duì)較少。同時(shí)，含有IFN-γ基因的重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)上清作為包被抗原，間接 ELISA能敏感、特異地與兔抗原核表達(dá)IFN-γ免疫血清中的特異性抗體反應(yīng)。結(jié)果表明，重組桿狀病毒表達(dá)的重組IFN-γ蛋白經(jīng)過翻譯后的加工與修飾作用，和天然IFN-γ一樣可以進(jìn)行分泌型表達(dá)。（2）傳統(tǒng)的干擾素抗病毒活性是利用細(xì)胞病變抑制法測定，通過肉眼或顯微鏡觀察噬斑的數(shù)量而確定其活性單位，本實(shí)驗(yàn)采用的重組VSV*GFP可以在感染宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白，通過觀察熒光強(qiáng)度和數(shù)量，便可確定其感染和復(fù)制情況，因此通過測定其熒光強(qiáng)度和數(shù)量就可以確定干擾素的活性單位，使得干擾素活性的測定更加準(zhǔn)確和簡便。在利用細(xì)胞病變抑制法測定重組IFN-γ抗病毒活性的試驗(yàn)中，重組IFN-γ稀釋倍數(shù)相同時(shí)，重組DIFN-γ熒光強(qiáng)度要明顯強(qiáng)于其它兩種干擾素，原因可能是PK-15細(xì)胞對(duì)VSV病毒更為敏感。（3）由于重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的IFN-γ經(jīng)過了更多的翻譯后加工與修飾作用，因而在結(jié)構(gòu)與功能上更接近于天然IFN-γ。這為進(jìn)一步對(duì)IFN-γ結(jié)構(gòu)與功能的研究提供了方便。同時(shí)，重組桿狀病毒表達(dá)的重組IFN-γ具有高效的抗病毒活性，也為臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1]Gerotto M,Dalpero F,Pontisso P,et al.Two PKR inhibitor HCV proteins correlate with early but not sustained response to interferon.Gastroenterology,2000,119(6):1649-1655.

[2]Chin YE,Kitagawam,Su WC,et al.Cell grow th arrest and induction of cyclin-dependent kinase inhibitor P21 mediated by STAT1.Science,1996,272:719-722.

[3]Bromberg IF,Horvath CM,Wen Z,etal.Transcriptionally active stat1 is required for the anti-protiferative effects of both interferon-αand interferonγ.Proc Natl Acad Sci,1996,93:7673-7678.

[4]Liebana E,Aranaz A,Urquia JJ,et al.Evaluation of the gammainterferon assay for eradication of tuberculosis in goat herd.Aust Vet J,1998,76(1):50-53.

[5]Palmer MV,WatersWR,Whipple DL,et al.Evaluation of an in vitro blood-based assay to detect production of interferon-gamma by Mycobacterium bovis-infected white-tailed deer(Odocoileus virginianus).JVetDiabn Invest,2004,16(1):17-21.