趙香勝 李瑞典（河北省任丘市畜牧水產(chǎn)局 062550）

禽白血病病毒(AvianLeukosisVirus,ALV)屬反轉(zhuǎn)錄病毒科禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬成員，可引起禽類(lèi)多種腫瘤性疾病[1]。該病毒可分為A到J10個(gè)亞群，臨床上常見(jiàn)的為A、B和J亞型，而C、D亞型在臨床上相對(duì)少見(jiàn)，E亞群主要以前病毒的形式存在于宿主基因組而廣泛存在[2]。由于ALV病毒基因組變異較快，目前尚未有商業(yè)化疫苗可供使用，實(shí)施嚴(yán)格的凈化措施是唯一有效的防控方法[3]。

近年來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)禽白血病病毒檢測(cè)和防控力度的加強(qiáng)，我國(guó)白羽肉雞和蛋用型雞群祖代雞ALV感染已得到有效控制。然而，我國(guó)地方品系雞分布廣泛，品種繁多，因此我國(guó)地方品系雞禽白血病的防控和凈化面臨著較大挑戰(zhàn)，ALV的感染和流行依然存在。同時(shí)，近些年中國(guó)地方品系雞種的保護(hù)工作逐漸受到重視[4]。黔東南小香雞是我國(guó)特有的地方品系雞，羽毛色彩豐富多樣，外表華麗，肉質(zhì)細(xì)嫩香醇，市場(chǎng)前景良好。為了解我國(guó)黔東南小香雞的ALV感染狀況，為凈化和保種工作提供技術(shù)支持，本研究對(duì)我國(guó)某地方品系雞黔東南小香雞保種雞群進(jìn)行了ALV的流行病學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料（1）主要試劑和儀器：ALV抗原檢測(cè)試劑盒，ALV-J、ALV-AB抗體檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自IDEXX公司；病毒RNA提取試劑購(gòu)自O(shè)MEGA公司；RT-PCR反應(yīng)試劑、DL2000Marker、PMD-18T載體購(gòu)自大連寶生物公司，其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。（2）細(xì)胞：可區(qū)分內(nèi)外源ALV的雞胚成纖維細(xì)胞系DF-1細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存、傳代。

1.2 血清ALV抗體和蛋清ALV抗原的檢測(cè) 在該場(chǎng)240日齡的黔東南小香雞保種雞群中，隨機(jī)抽取54只雞(母雞40只，公雞14只)，每只雞分別常規(guī)采血0.2～0.5ml，分離血清，使用IDEXX公司ALV抗體檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)ALV-J和ALV-AB特異性抗體。同時(shí)，收集該保種雞群40枚雞蛋，使用IDEXX公司ALV抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋清中ALVp27抗原。

1.3 病毒分離培養(yǎng) 將p27抗原陽(yáng)性蛋清經(jīng)0.24μm濾器過(guò)濾后接種DF1細(xì)胞系，維持7d后盲傳一代，7d后取上清使用ALV抗原檢測(cè)試劑盒(IDEXX公司)檢測(cè)p27抗原，陽(yáng)性者收集細(xì)胞上清和DF1細(xì)胞，所分離病毒置于液氮中保存，并將其命名為QDN-13。

1.4 細(xì)胞DNA的提取 將上清p27抗原陽(yáng)性的DF1細(xì)胞用PBS清洗1-2遍，加500μl組織抽提液，5μl蛋白酶K，55℃消化過(guò)夜。用苯酚氯仿抽提提取DNA，50μlddH2O溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ALV的PCR擴(kuò)增和克隆測(cè)序 根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，使用針對(duì)env基因兩側(cè)保守區(qū)的通用引物，PCR擴(kuò)增env基因的約1.9kb片段。引物如表1所示。PCR反應(yīng)體系如下：10XPCRbuffer2.5μl， Mg2+*(25mM)2μl， dNTP(2.5mM)2μl，上下游引物各0.5μl，模板DNA2μl，rTaqDNA聚合酶0.5μl，ddH2015μl，共25μL。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃ 5min，變性95℃ 1min，復(fù)性55℃ 50s，延伸72℃2min，共30個(gè)循環(huán)，復(fù)延伸72℃10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收，使用OMEGA凝膠回收試劑盒純化PCR片段，與PMD-18T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌，挑取白色菌落，酶切驗(yàn)證后挑選陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序。根據(jù)所得序列推導(dǎo)其gp85氨基酸序列。1.6 ZJ13-QDN-2分離株與各亞群參考株同源性和遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 使用DNAstar5.0軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接、同源性分析和病毒的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析。用于比較的不同亞群ALV參考株及其信息見(jiàn)表2所示。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

表2 各亞群參考株信息

2 結(jié)果

2.1 黔東南小香雞ALV感染狀況 血清抗體的檢測(cè)結(jié)果表明，該保種雞場(chǎng)的黔東南小香雞保種雞群存在著ALV-J和ALV-AB的混合感染。該群雞ALV-AB的陽(yáng)性率為16.70%，而ALV-J抗體陽(yáng)性率僅為1.9%；并且，公雞ALVAB抗體陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于母雞。蛋清ALV抗原檢測(cè)結(jié)果表明，有高達(dá)27.50%的蛋清為P27抗原陽(yáng)性，這表明，垂直傳播在ALV的傳播過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

表3 黔東南小香雞ALV抗原及ALV-JALV-AB抗體陽(yáng)性率

2.2 蛋清中ALV的分離鑒定 將p27抗原檢測(cè)陽(yáng)性的蛋清接種DF1細(xì)胞，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，收集細(xì)胞上清檢測(cè)ALVp27抗原。對(duì)p27抗原陽(yáng)性細(xì)胞使用ALVA/B單因子血清[6]和ALV-J單抗JE9通過(guò)IFA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，我們?cè)陉?yáng)性蛋清中分離到一株外源性ALV，并將其定名為ZJ13-QDN-2。

2.3 ZJ13-QDN-2分離株與參考株之間同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 對(duì)ALV前病毒DNA的env基因克隆測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，SDAU14A1的gp85基因長(zhǎng)度為1035bp，推導(dǎo)其編碼344aa的gp85蛋白。序列比對(duì)表明，SDAU14A1的gp85氨基酸序列與A亞群ALV參考株之間同源性為93.1%(89.7%～98.0%)，與B亞群ALV參考株之間同源性平均值為79.5%(79.3%～79.8%)，與C亞群ALV參考株之間同源性為84.6%，與D亞群ALV參考株之間同源性為83.1%，與E亞群ALV參考株之間同源性平均值為84.4%(84.1%～84.7%)，與J亞群ALV參考株之間同源性平均值為38.3%。ZJ13-QDN-2的gp85氨基酸僅與A亞群ALV的同源性高于80%，與其他亞群同源性均較低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也表明，我們分離到的ZJ13-QDN-2株屬于A亞群ALV。值得注意的是，ZJ13-QDN-2的gp85在氨基酸水平上與分離自法國(guó)的MAV-1、分離自其余地方品系雞的毒株LH091101A在同一進(jìn)化枝上，這暗示，盲目引種及不當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)管理可能是造成該群雞感染ALV-A的原因。

圖1 ZJ13-QDN-2的gp85蛋白與其余參考株同源性比對(duì)

圖2 ZJ13-QDN-2的gp85蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

ALV是一種主要通過(guò)垂直傳播的的反轉(zhuǎn)錄病毒，除了可以誘發(fā)雞的腫瘤，ALV感染還可引起雞產(chǎn)蛋下降和免疫抑制，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。經(jīng)過(guò)十余年努力，雖然我國(guó)的白羽肉雞和蛋用型祖代雞基本實(shí)現(xiàn)了ALV的凈化，但由于飼養(yǎng)管理不善、缺乏嚴(yán)格的監(jiān)控措施等多種原因，ALV在我國(guó)地方品系雞中仍呈現(xiàn)大規(guī)模感染和局部流行的態(tài)勢(shì)。繼成子強(qiáng)在中國(guó)麻雞中發(fā)現(xiàn)ALV-J的感染后，研究人員先后在山東壽光雞、蘆花雞、百日雞、瑯琊雞、魯西斗雞、廣西黑雞、龍勝鳳雞、廣西三黃雞、烏骨雞等我國(guó)特有品系雞中分離鑒定到ALV[8-12]。在這些雞群中，普遍存在著ALV-J的感染，也有的品系表現(xiàn)ALV-A/B的流行，甚至共感染。在前期調(diào)查中，我國(guó)6個(gè)省的28個(gè)地方品系雞中有22個(gè)地方品系雞ALV-A、ALV-B抗體呈現(xiàn)陽(yáng)性，23個(gè)地方品系雞對(duì)ALV-J抗體呈陽(yáng)性。這表明，我國(guó)地方品系雞中ALV的凈化防控任務(wù)依然艱巨。

本研究通過(guò)對(duì)我國(guó)某保種雞場(chǎng)的黔東南小香雞保種雞群進(jìn)行ALV的流行病學(xué)調(diào)查，以期為ALV的凈化工作提供依據(jù)，為我國(guó)優(yōu)良品系雞的保種工作提供保障。血清流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果表明，在該群雞中，存在著ALV-J和ALV-AB的混合感染，以ALV-AB的感染為主，并且，公雞中ALV-AB抗體陽(yáng)性率顯著高于母雞。有研究表明，公雞的精液可以作為ALV傳播的載體，這提示我們?cè)趯?duì)該群雞ALV凈化中，需要加強(qiáng)對(duì)公雞的檢測(cè)淘汰力度。本研究將ALV抗原陽(yáng)性蛋清接種DF-1細(xì)胞，成功分離到一株外源ALV病毒，env基因的克隆測(cè)序結(jié)果表明，ZJ13-QDN-2分離株為A亞群ALV，這與血清學(xué)調(diào)查的結(jié)果相吻合。Gp85序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，該分離株與分離自法國(guó)的MAV-1、分離自其余地方品系雞的毒株LH091101A在同一進(jìn)化枝上，它們之間具有較高的同源性。這暗示，該分離株有可能是在國(guó)外引種過(guò)程中帶入我國(guó)的。由于引種時(shí)檢疫不嚴(yán)，引種后管理不善，使得病毒感染了雞場(chǎng)的該雞群。另外，需要指出的是，本研究在該黔東南小香雞保種雞群中僅分離到A亞群ALV，但并不能排除該雞群中其他亞群的感染。該雞群ALV-J抗體陽(yáng)性率為1.90%，表明該雞群可能曾經(jīng)或者正在經(jīng)歷ALVJ的感染。

總之，本研究對(duì)我國(guó)某保種雞場(chǎng)的黔東南小香雞保種雞群進(jìn)行了ALV的流行病學(xué)調(diào)查，并在ALV抗原陽(yáng)性的蛋清中分離到一株A亞群ALV。這為黔東南小香雞ALV的凈化、優(yōu)良品種的保藏培育提供了技術(shù)支持，也給研究黔東南小香雞ALV的來(lái)源、遺傳關(guān)系提供了有力的材料。我們需要加強(qiáng)對(duì)該黔東南小香雞保種雞群ALV的檢測(cè)力度，實(shí)施更加嚴(yán)格的凈化淘汰措施，同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，避免ALV在雞群中的橫向傳播，為全面提高種禽健康水平奠定基礎(chǔ)。

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