趙舒怡，張臻峰，黃熙泰

(1.國家電網(wǎng)技術(shù)學(xué)院泰山校區(qū)，山東泰安271000;2.中國科學(xué)院微生物研究所微生物前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101;3.南開大學(xué)生命科學(xué)院，天津300071)

DNA是細(xì)胞內(nèi)最主要的遺傳物質(zhì)，其三維結(jié)構(gòu)對細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄等生理活動有非常大的影響。因此，研究DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形式及其包裝方式具有非常重要的意義。DNA超螺旋對于細(xì)胞活性來說是必需的，因此在細(xì)胞內(nèi)是受到嚴(yán)密調(diào)控的［1］。胞內(nèi)超螺旋程度受特定酶 (DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和旋轉(zhuǎn)酶)的控制，它們可以在DNA分子上引入或者去除超螺旋［2－5］。

基因的轉(zhuǎn)錄也對DNA的超螺旋狀態(tài)也有很大的影響。在轉(zhuǎn)錄過程中，在轉(zhuǎn)錄復(fù)合體前方和后方DNA分別生成數(shù)量相當(dāng)?shù)恼菪拓?fù)超螺旋。而這些超螺旋可以通過多種途徑進(jìn)行消除，包括DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用，DNA雙螺旋與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的相互旋轉(zhuǎn)使正超螺旋和負(fù)超螺旋互補(bǔ)消除等［6］。轉(zhuǎn)錄的過程中，在特定的拓?fù)洚悩?gòu)酶失活的情況下，如果DNA雙螺旋鏈與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的相互旋轉(zhuǎn)同時也被阻止或者被限制，那么就會積累相應(yīng)的超螺旋。因此，在拓?fù)洚悩?gòu)酶I缺失的菌株中，tetA的共轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)使其產(chǎn)物的氨基端的膜插入?yún)^(qū)結(jié)合到細(xì)胞質(zhì)膜上，或者其他某些DNA結(jié)合蛋白 (如LacⅠ)結(jié)合到DNA雙鏈上［7］，均可阻止DNA鏈和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的相互旋轉(zhuǎn)，在旋轉(zhuǎn)酶 (gyrase)的作用下，引入負(fù)超螺旋，最終導(dǎo)致高度負(fù)超螺旋的產(chǎn)生［8－9］。通過對 pBR322質(zhì)粒 DNA 詳細(xì)的研究，Liu和Wang［10］認(rèn)為這種負(fù)超螺旋增加是由于DNA模板在轉(zhuǎn)錄過程中的分子操作造成的，進(jìn)而提出了“孿生超螺旋結(jié)構(gòu)域”模型。而且孿生結(jié)構(gòu)域?qū)е碌母叨蓉?fù)超螺旋的形成依賴于膜結(jié)合蛋白如tetA蛋白，同時也依賴于轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的數(shù)量以及轉(zhuǎn)錄的相對方向［8，10］。另外，Drolet和 Liu等［11］又提出了R－loop模型，即在轉(zhuǎn)錄延伸過程中形成的新生RNA鏈在轉(zhuǎn)錄復(fù)合物后方與其模板鏈形成RNA－DNA雜交雙螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致了后續(xù)的超螺旋的產(chǎn)生，而高濃度的RNase H(特異性的降解RNA－DNA雜交鏈中的RNA)可以消除轉(zhuǎn)錄延伸過程中產(chǎn)生的負(fù)超螺旋［12－13］。在該假說中，DNA負(fù)超螺旋的形成依賴于轉(zhuǎn)錄的延伸，并且DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在穩(wěn)定該種結(jié)構(gòu)方面起著重要的作用。R－loop可以穩(wěn)定負(fù)超螺旋，同時高度的負(fù)超螺旋又促進(jìn)R－loop的形成。

近十幾年來，多個課題組利用體外［7，14］或體內(nèi)［15－18］的轉(zhuǎn)錄體系證明，在體系中存在旋轉(zhuǎn)酶(Gyrase)而缺失拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)時高效的轉(zhuǎn)錄可以促進(jìn)質(zhì)粒DNA負(fù)超螺旋的積累并形成高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu) (Hypernegatively supercoiled DNA)。然而，需要指出的是這些研究中使用的均為單一的、相對較短的轉(zhuǎn)錄單元。而在細(xì)菌染色體上存在很多大的基因或基因簇，它們的轉(zhuǎn)錄單位通常都很大，這種長距離的轉(zhuǎn)錄可能會對DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更大的影響。為了研究這種影響，我們使用pJGX15A作為報告質(zhì)粒。該質(zhì)粒的構(gòu)建是直接將含有結(jié)構(gòu)基因簇cfaABCE的DNA片段直接插入到tetA基因的下游［19］。由于插入片段上不帶有啟動子，該基因簇與tetA基因共轉(zhuǎn)錄并形成一個長的轉(zhuǎn)錄單位。此前的研究已證明在兩種菌株中CFA/I均可以很好的表達(dá)并組裝形成菌毛［19］。本課題的研究結(jié)果表明，在大腸桿菌topA－細(xì)胞中，tetA－cfaABCE的高效轉(zhuǎn)錄可以促使pJGX15A形成一種部分高度凝集的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)在氯喹－瓊脂糖凝膠電泳具有較高的遷移率并表現(xiàn)為“彌散”狀態(tài)。原子力顯微鏡的觀察結(jié)構(gòu)表明這種質(zhì)粒DNA分子中含有不同程度的凝集結(jié)構(gòu)且其結(jié)構(gòu)參數(shù)明顯有別于超螺旋質(zhì)粒DNA。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 溶菌酶、SDS、PEG6000、溴化乙錠(EB)、氯喹等購自Sigma公司。胰蛋白胨、酵母提取物以及瓊脂糖購自O(shè)xoid公司。Tris、EDTA、NaOH、NaCl、MgCl2等常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。Taq酶、PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自上海生工，PCR引物由上海生工合成。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 大腸桿菌 HB101(topA+，gyrB+)與DM800(topA－，gyrB225)均由紐約公共衛(wèi)生研究所Dr.Drlica提供，質(zhì)粒pJGX15A(圖1)則由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院徐建國教授提供［19］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及質(zhì)粒提取 挑取大腸桿菌單菌落至5 mL LB試管中，37℃，200 r/min搖床震蕩培養(yǎng)過夜。然后將菌液接種到200 mL新鮮的LB培養(yǎng)基中，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)，并監(jiān)測菌液在600 nm處的光吸收值。本研究中所有培養(yǎng)基中均添加了100 μg/mL氨芐青霉素;并根據(jù)需要分別添加0、6、12 μg/mL的四環(huán)素。當(dāng)培養(yǎng)至所需的細(xì)胞生長時期后，離心 (6000 r/min，5 min)收集菌體，并提取質(zhì)粒DNA。為避免菌體裂解過程中堿性試劑對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的損傷，采用溫和的清亮裂解方法提取質(zhì)粒 DNA［20］。

圖1 質(zhì)粒pJGX15A的限制圖Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pJGX15A

1.2.2 氯喹－瓊脂糖凝膠電泳 鑒于pJGX15A質(zhì)粒較大，因此采用w=0.6%的瓊脂糖凝膠電泳分析其DNA超螺旋狀態(tài)。制備凝膠前，1×TAE緩沖液中加人適量的氯喹母液 (10 mg/mL)使其達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的濃度，再加人瓊脂糖，加熱制膠。電泳緩沖液中氯喹濃度應(yīng)與瓊脂糖凝膠中一致。電泳電壓為75 V，時間為 12 h。電泳結(jié)束后，在 10 mmol/L MgCl2中脫色30 min，在0.5 μg/mL EB 溶液中染色1 h，再脫色30 min后，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照。在所有實(shí)驗(yàn)中，上樣孔中均無殘留DNA。

1.2.3 原子力顯微鏡成像 本實(shí)驗(yàn)利用二價離子將DNA橋聯(lián)吸附在帶負(fù)電的云母表面。將DNA樣品稀釋到1 μg/mL，向其中加入MgCl2至終濃度為1 mmol/L。取15 μL樣品滴加到新剝離的云母片上，室溫吸附5 min。100 μL去離子水潤洗3遍，去除未吸附的DNA，然后用氮?dú)獯蹈? min。使用Nanoscope Ⅲ a Multimode－AFM instrument(Digital Instruments)在室溫下利用輕敲模式 (Tapping mode)下進(jìn)行掃描。探針使用共振頻率為106 kHz的 Super－sharp silicon tips(Silicon－MDT Ltd.)，掃描速度為1～2 Hz。開始掃描后調(diào)整設(shè)定的參數(shù)值以確保將干擾降至最低并保持圖像清晰。

DNA分子的長度利用軟件 ImageJ Ver1.33u(Wayne Rasband，National Institute of Health，USA)進(jìn)行測量;高度與寬度則使用原子力顯微鏡自帶的軟件進(jìn)行測量。

2 結(jié)果

2.1 pJGX15 A在兩種宿主中的超螺旋水平

在添加了100 μg/mL氨芐青霉素和12 μg/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，將含有pJGX15A的大腸桿菌HB101與DM800菌株分別培養(yǎng)到對數(shù)前期(A600約為0.4)和中期 (A600約為0.8)，提取質(zhì)粒DNA，并對其進(jìn)行氯喹－瓊脂糖凝膠電泳分析其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。圖2中A、B、C分別表示電泳體系中氯喹濃度逐漸增加時質(zhì)粒pJGX15A的電泳情況。隨著氯喹濃度的增加，質(zhì)粒DNA的負(fù)超螺旋水平由于氯喹嵌入的逐漸增加而逐漸降低，產(chǎn)生從負(fù)超螺旋—松弛—正超螺旋的轉(zhuǎn)變。

圖2 質(zhì)粒pJGX15A在HB101與DM800細(xì)胞中的超螺旋水平Fig.2 Agarose gel electrophoresis of pJGX15A DNA in the presence of 5 μg/mL(A)，20 μg/mL(B)or 35 μg/mL(C)chloroquine The plasmid DNA samples were isolated from cells cultured in LB mediums containing 12 μg/mL tetracycline to the early－or mid－exponential phase.Lane 1:pJGX15A from HB101 cells in the early－exponential phase;lane 2:pJGX15A from HB101 cells in the mid－exponential phase;lane 3:pJGX15A from DM800 cells in the early－exponential phase;lane 4:pJGX15A from DM800 cells in the mid－exponential phase.OC/R:open circular or relaxed plasmid DNA;Sc:supercoiled plasmid DNA

結(jié)果顯示，宿主DM800中的pJGX15A拓?fù)洚悩?gòu)體分布范圍較廣，而宿主HB101中的pJGX15A的拓?fù)洚悩?gòu)體則比較集中。這是由于DM800存在topA缺失以及gyrB225的補(bǔ)償突變，使得其對胞內(nèi)DNA超螺旋水平的控制能力較差所造成的。圖2A中結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度氯喹 (5 μg/mL)中HB101和 DM800中的pJGX15A均為負(fù)超螺旋狀態(tài)，且DM800中的pJGX15A泳動速度較快。圖3B中結(jié)果顯示，提高氯喹質(zhì)量濃度至20 μg/mL時，HB101中pJGX15A大部分拓?fù)洚悩?gòu)體由于氯喹的嵌入使其DNA結(jié)構(gòu)接近于松弛環(huán)形DNA;而DM800中pJGX15A則仍有部分拓?fù)洚悩?gòu)體保持較高的負(fù)超螺旋水平，因而泳動速度較快。圖3C中結(jié)果顯示，提高氯喹質(zhì)量濃度至35 μg/mL時，兩種宿主中pJGX15A大拓?fù)洚悩?gòu)體由于氯喹的嵌入均變?yōu)檎菪?，而DM800中pJGX15A部分拓?fù)洚悩?gòu)體則形成高程度的正超螺旋，泳動速度較快。但需要注意的是，每個DNA樣品中各拓?fù)洚悩?gòu)體DNA的含量呈正態(tài)分布，因此比較種宿主質(zhì)粒DNA拓?fù)洚悩?gòu)體主體的超螺旋狀態(tài)可以發(fā)現(xiàn)pJGX15A在二者中的平均超螺旋狀態(tài)基本一致。綜合以上結(jié)果，pJGX15A在宿主DM800中既含有高度負(fù)超螺旋的結(jié)構(gòu)同時也含有低負(fù)超螺旋的結(jié)構(gòu)，但其平均超螺旋水平與HB101中的質(zhì)粒DNA相當(dāng)。

2.2 DM800 菌株中pJGX15 A的特殊結(jié)構(gòu)形式

早先的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)攜帶四環(huán)素抗性基因tetA的質(zhì)粒pBR322在大腸桿菌topA－菌株DM800中具有高度的負(fù)超螺旋水平［8］，這一點(diǎn)與我們上述的結(jié)果并不完全吻合。在實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加高濃度四環(huán)素后攜帶pJGX15A質(zhì)粒的兩種宿主菌均生長變緩，而攜帶pBR322質(zhì)粒的宿主菌的生長則沒有明顯變化 (數(shù)據(jù)未給出)，推測這一點(diǎn)可能是導(dǎo)致兩種質(zhì)粒DNA在DM800中的超螺旋水平有區(qū)別的原因，因此我們嘗試降低培養(yǎng)基中的四環(huán)素質(zhì)量濃度并重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。圖3中的結(jié)果顯示，當(dāng)四環(huán)素質(zhì)量濃度降低到 6 μg/mL時，pJGX15A在DM800菌株中的超螺旋水平明顯高于HB101菌株;而當(dāng)培養(yǎng)基中不添加四環(huán)素時，pJGX15A在DM800菌株中的超螺旋水平不僅明顯高于HB101菌株，而且對數(shù)前期DM800細(xì)胞中提取的pJGX15A在電泳中表現(xiàn)出典型的“負(fù)超螺旋—高度負(fù)超螺旋”模式 (圖3:3泳道)。仔細(xì)分析圖3中pJGX15A的拓?fù)洚悩?gòu)體在電泳中的分布模式可以發(fā)現(xiàn)，DM800細(xì)胞中的pJGX15A在電泳中不能被分離為清晰的拓?fù)錀l帶，而是表現(xiàn)為泳動速度較快的“彌散”條帶。這一點(diǎn)與高質(zhì)量濃度四環(huán)素培養(yǎng)時的結(jié)果形成了鮮明的對比。這些結(jié)果表明，在四環(huán)素質(zhì)量濃度較低時對數(shù)期DM800細(xì)胞中的pJGX15A形成了特殊的結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)有別于通常意義的超螺旋結(jié)構(gòu)，可能是一種新的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形式。

圖3 DM800細(xì)胞中質(zhì)粒pJGX15A形成特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)形式Fig.3 Agarose gel electrophoresis of pJGX15A DNA in the presence of 5 μg/mL chloroquineThe plasmid DNA samples were isolated from cells in the early－(lanes 1，3，5 and 7)or mid－exponential phase(lanes 2，4，6 and 8).OC/R，open circular or relaxed plasmid DNA;Sc，supercoiled plasmid DNA;(－－)，hypernegatively supercoiled plasmid DNA

2.3 四環(huán)素質(zhì)量濃度與細(xì)胞生長時期對pJGX15A特殊結(jié)構(gòu)的影響

進(jìn)一步對比圖3中的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對數(shù)前期與中期的HB101細(xì)胞中的pJGX15A的結(jié)構(gòu)基本一致，然而DM800細(xì)胞中提取的pJGX15A的結(jié)構(gòu)在兩個時期則有明顯的不同——對數(shù)前期的pJGX15A超螺旋水平更高，也更易于形成“彌散”條帶。這一點(diǎn)也促使我們進(jìn)一步探討細(xì)胞生長時期對pJGX15A拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響。在不同四環(huán)素質(zhì)量濃度下培養(yǎng)HB101與DM800，分別收集對數(shù)期以及靜止期的細(xì)胞并提取質(zhì)粒DNA，然后利用氯喹－瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu) (如圖4所示)。結(jié)果顯示，四環(huán)素質(zhì)量濃度與生長時期對pJGX15A在DM800中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)均具有顯著的影響。

當(dāng)培養(yǎng)基中不添加四環(huán)素時，從DM800對數(shù)生長期細(xì)胞和靜止期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA樣品之間有很大的區(qū)別 (圖4:泳道3、4)。首先，從DM800對數(shù)生長期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA的超螺旋程度很高，其中大部分都表現(xiàn)為類似高度負(fù)超螺旋的狀態(tài)。其次，從DM800對數(shù)生長期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA樣品中的拓?fù)洚悩?gòu)體不能被電泳分離，但靜止期細(xì)胞中提取的質(zhì)粒DNA樣品那樣。在topA突變體中tetA基因的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)被證實(shí)可以形成高度負(fù)超螺旋［9］，然而，這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)的形成說明串聯(lián)基因tetA－cfaABCE長距離的轉(zhuǎn)錄能夠促使DNA產(chǎn)生更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)的形成同樣受到培養(yǎng)基中四環(huán)素質(zhì)量濃度的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)提高培養(yǎng)基中的四環(huán)素質(zhì)量濃度時，質(zhì)粒DNA的超螺旋程度隨之下降;并且當(dāng)四環(huán)素質(zhì)量濃度達(dá)到12 μg/mL時，不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)不能形成。由于四環(huán)素是一種轉(zhuǎn)錄抑制劑，因此可能是由于轉(zhuǎn)錄速度下降導(dǎo)致不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)不能形成。

圖4 四環(huán)素質(zhì)量濃度與細(xì)胞生長時期對pJGX15A結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Agarose gel electrophoresis of pJGX15A in the presence of 5 μg/mL chloroquineThe plasmid DNA samples were then isolated from cells in the exponential(E)or stationary(S)phase.OC/R，open circular or relaxed plasmid DNA;Sc，supercoiled plasmid DNA;(－－)，hypernegatively supercoiled plasmid DNA.

2.4 AFM觀察pJGX15 A的特殊結(jié)構(gòu)

為深入了解pJGX15A在DM800細(xì)胞中形成的特殊結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)特征及其與超螺旋DNA的區(qū)別，我們選擇在不添加四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期及靜止期的DM800細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA樣品，利用原子力顯微鏡技術(shù)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察與分析。其中使用的Mg2+濃度 (1 mmol/L)在細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度的范圍內(nèi)，正如之前討論過的一樣，在這種Mg2+濃度下AFM可以給出可信的圖片［21］。如圖5所示，兩種樣品中幾乎所有的DNA分子均為閉合環(huán)狀分子，表明樣品制備并未破壞DNA的結(jié)構(gòu)。圖5A中顯示了DM800靜止期細(xì)胞中提取的pJGX15A，DNA的結(jié)構(gòu)非常均一，不含有復(fù)雜結(jié)構(gòu);大部分DNA分子呈現(xiàn)松弛或者1～2次互纏式結(jié)構(gòu)，這可能是由于其超螺旋水平較低的緣故。而與此相反，DM800對數(shù)期細(xì)胞中提取的pJGX15A則表現(xiàn)出非常高的結(jié)構(gòu)多樣性 (圖5B)。幾乎所有DNA分子均表現(xiàn)出不同程度的凝集，大部分分子含有多個扭結(jié) (圖5B中箭頭)，甚至有些DNA分子完全壓縮成了一團(tuán) (圖5B中白色三角)。這種形態(tài)的多樣性可能正是導(dǎo)致這些拓?fù)洚悩?gòu)體不能被氯喹瓊脂糖凝膠電泳分離形成梯狀條帶的原因。

圖5 AFM觀察超螺旋與凝集pJGX15A的結(jié)構(gòu)Fig.5 AFM images of supercoild(A)and condensed(B)pJGX15A from DM800 cells Grayscale represents 5 nm

圖 6B－E中展示了幾個凝集程度不同的pJGX15A分子，與圖6A中的超螺旋DNA分子的結(jié)構(gòu)相比較可以發(fā)現(xiàn)，這些發(fā)生凝集的DNA分子尺寸小于超螺旋DNA分子。圖6A中超螺旋DNA分子的長度為2756 nm，與其理論計算長度2779 nm非常接近。而圖6B－D中所示DNA分子的展開部分的鏈的長度則分別為2710、2640以及1394 nm;圖6E中的結(jié)構(gòu)不含有展開的DNA鏈且被完全壓縮成了一團(tuán)。這些數(shù)據(jù)表明，質(zhì)粒DNA分子中的部分DNA雙鏈確實(shí)在不同程度上被壓縮成凝集結(jié)構(gòu)，而且凝集程度越高，DNA分子的表觀長度則越小。進(jìn)一步對這些分子的高度進(jìn)行了測量，結(jié)果顯示所有DNA分子中展開的雙鏈DNA的高度基本一致，約為1.1～1.3 nm，然而凝集部分的高度則有很大區(qū)別。圖6E中的結(jié)構(gòu)的平均高度約為3.8 nm，與圖6D中DNA分子的凝集部分的高度(約為3.9 nm)相似，但是卻大于圖6C中DNA分子的凝集部分的高度 (約為2.1 nm)同時遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于圖6A中DNA鏈的高度 (約為1.2 nm)。

圖6 幾種典型的pJGX15A分子的結(jié)構(gòu)Fig.6 AFM images of representative supercoiled(A)or condensed(B－E)structures of plasmid pJGX15A from DM800 Grayscale represents 5 nm

3 討論

轉(zhuǎn)錄對DNA結(jié)構(gòu)的影響已經(jīng)研究了很長時間了。Liu 和 Wang［8，10］提出了轉(zhuǎn)錄的孿生結(jié)構(gòu)域模型，而Drolet等［11－12］則提出DNA模板的高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的形成是與R－loop(s)的形成緊密聯(lián)系在一起的。這些假說解釋了轉(zhuǎn)錄是如何刺激DNA模版的高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)的積累的，同時闡述了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I以及旋轉(zhuǎn)酶在轉(zhuǎn)錄過程中的作用。然而，tetA基因的轉(zhuǎn)錄單位只有1190 bp，不足以促使DNA形成更加復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用大質(zhì)粒pJGX15A來研究長距離轉(zhuǎn)錄對DNA結(jié)構(gòu)的影響。該質(zhì)粒包含一個tetA－cfaABCE共轉(zhuǎn)錄單位，這個共轉(zhuǎn)錄單位由tetA啟動，并且新生的tetA多肽同樣可以錨定在細(xì)胞膜上，這一點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)對轉(zhuǎn)錄所引起的結(jié)構(gòu)變化是非常重要的［22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒 pJGX15A在大腸桿菌topA－菌株DM800中形成一種特殊的凝集結(jié)構(gòu)。這種凝集結(jié)構(gòu)在氯喹－瓊脂糖凝膠電泳中有著很高的遷移率而且表現(xiàn)為類似“彌散”的條帶，這一點(diǎn)與正常超螺旋結(jié)構(gòu)有很大的區(qū)別。AFM照片也顯示這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)不包含超螺旋。相反，它們包含分枝狀的、高度凝集的結(jié)構(gòu) (圖5B中箭號所示)，部分分子甚至完全凝集成為一團(tuán) (圖5B中三角所示)。這也許是這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)有著很高的電泳遷移率并且拓?fù)洚悩?gòu)體不能被電泳分離的原因。與此前發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pBR322所形成高負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)相比，pJGX15A在DM800細(xì)胞中形成的凝集結(jié)構(gòu)更加的復(fù)雜，說明長轉(zhuǎn)錄單元對DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了巨大的影響。

本實(shí)驗(yàn)中這種凝集結(jié)構(gòu)在大腸桿菌HB101細(xì)胞中并沒有發(fā)現(xiàn)，說明pJGX15A凝集結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生是依賴于拓?fù)洚悩?gòu)酶I的缺陷的。同時，這種凝集結(jié)構(gòu)的形成在很大程度上受到細(xì)胞生長狀態(tài)和培養(yǎng)基中四環(huán)素質(zhì)量濃度的影響:①該凝集結(jié)構(gòu)僅在DM800對數(shù)生長期細(xì)胞中形成，而當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入靜止期時，pJGX15A表現(xiàn)為超螺旋結(jié)構(gòu);②pJGX15A的凝集結(jié)構(gòu)僅在低四環(huán)素質(zhì)量濃度 (小于6 μg/mL)培養(yǎng)的DM800細(xì)胞中產(chǎn)生，高四環(huán)素質(zhì)量濃度培養(yǎng)時，對數(shù)期與靜止期DM800細(xì)胞中的pJGX15A均表現(xiàn)為超螺旋結(jié)構(gòu)。由于進(jìn)入靜止期和增加培養(yǎng)基中的四環(huán)素質(zhì)量濃度都會降低轉(zhuǎn)錄的效率，因此推測這種不規(guī)則凝集結(jié)構(gòu)的生成依賴于高效的轉(zhuǎn)錄。

此前有實(shí)驗(yàn)室從大腸桿菌 HB101(topA+，gyrB+)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了某種可變的不規(guī)則結(jié)構(gòu)［23］，具有這種結(jié)構(gòu)的DNA同樣不能被電泳分開成梯狀拓?fù)洚悩?gòu)體條帶。AFM的結(jié)果顯示該結(jié)構(gòu)中也含有凝集的結(jié)構(gòu)，與本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的凝集結(jié)構(gòu)有相似之處。但進(jìn)一步比較二者的結(jié)構(gòu)參數(shù)可以發(fā)現(xiàn)這種不規(guī)則結(jié)構(gòu)與本研究中發(fā)現(xiàn)的凝集結(jié)構(gòu)相比，其凝集程度明顯較低。這一點(diǎn)也與其超螺旋水平明顯低于本研究中發(fā)現(xiàn)的凝集結(jié)構(gòu)這一結(jié)果相符合。這些結(jié)果說明DNA凝集結(jié)構(gòu)可以在大腸桿菌野生株中產(chǎn)生，而拓?fù)洚悩?gòu)酶I的缺失可能促進(jìn)了DNA凝集的累積。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞中拓?fù)洚悩?gòu)酶I缺失時，長轉(zhuǎn)錄單元的高效轉(zhuǎn)錄可能促使質(zhì)粒DNA形成高度凝集的結(jié)構(gòu) (highly condensed structure)而非高度負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu) (hypernegative supercoiled structure)。鑒于細(xì)菌染色體上存在很多大的基因或基因簇，這種結(jié)構(gòu)的形成有可能參與細(xì)菌染色體DNA的組織包裝。

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