梁梓強(qiáng)，梁士可，張 梅，王方海

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//昆蟲學(xué)研究所，廣東廣州510275)

十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS－PAGE)結(jié)合考馬斯亮藍(lán) (Coomassie brilliant blue)染色法，可對(duì)不同型性的昆蟲個(gè)體進(jìn)行蛋白對(duì)比分析，不僅能快速得到各蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，并可進(jìn)行半定量分析，為進(jìn)一步研究型性差異的具體機(jī)制打下基礎(chǔ)。

褐飛虱Nilaparvata lugens(St?l)體型小，易遷飛，繁殖力強(qiáng)，為稻飛虱的一種。稻飛虱是半翅目中一類小型昆蟲，具有多型現(xiàn)象，即在同一種內(nèi)會(huì)出現(xiàn)前翅變短、后翅退化的個(gè)體，從而構(gòu)成長(zhǎng)、短兩種不同的翅型，其中短翅型的繁殖能力比長(zhǎng)翅型強(qiáng)，因此長(zhǎng)、短翅型的比率可影響褐飛虱的種群動(dòng)態(tài)［1］，同時(shí)雌、雄性比也是影響褐飛虱個(gè)體數(shù)量的關(guān)鍵原因［2－3］。因此，對(duì)褐飛虱翅型分化和性別比例作深入研究，不僅有助于我們對(duì)褐飛虱的發(fā)生作出更準(zhǔn)確的預(yù)報(bào)，而且也有益于我們探索新的控制飛虱危害的方法。

保幼激素是影響翅型分化的關(guān)鍵因子［4－5］，可被保幼激素酯酶降解［6］，而卵黃蛋白含量是評(píng)價(jià)雌性個(gè)體繁殖力的主要指標(biāo)之一［7］。故近幾年主要圍繞這些激素和蛋白對(duì)褐飛虱的繁殖和翅型分化的機(jī)理展開了大量的研究，但有關(guān)其它蛋白在翅型或性別分化中的作用則少有研究。鑒于褐飛虱蟲體可溶性蛋白的SDS－PAGE電泳分析尚未有報(bào)道，故本文對(duì)不同發(fā)育期的褐飛虱個(gè)體進(jìn)行了蛋白電泳分析，重點(diǎn)比較了不同翅型和不同性別個(gè)體間的蛋白圖譜差異，找出與翅型或性別相關(guān)聯(lián)的特異蛋白，以期進(jìn)一步解析飛虱翅型分化或性別分化機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx

褐飛虱成蟲采自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田內(nèi)，室內(nèi)進(jìn)行繁殖，采用水稻品種秈小占經(jīng)催芽播種后長(zhǎng)成的稻苗為飼料，飼養(yǎng)條件控制在28℃、RH 85%左右、燈光照明時(shí)間為16 h光照∶8 h黑暗。

1.2 血淋巴蛋白質(zhì)的提取

選取褐飛虱長(zhǎng)翅型雄成蟲、長(zhǎng)翅型雌成蟲、短翅型雄成蟲和短翅型雌成蟲各5頭，洗凈晾干，分別加入適量混有Protease Inhibitor Cocktail SetⅠ(Merck公司)的昆蟲生理鹽水后，隨機(jī)將蟲體剪成數(shù)塊，冰浴浸取30 min，期間震蕩搖勻2～3次，4℃離心后小心吸取上清。再次加入適量生理鹽水，重復(fù)操作一次。兩次上清混合液即為血淋巴蛋白質(zhì)樣品。并將沉淀物洗凈晾干，冰中保存，留待提取組織中可溶性蛋白用。

1.3 組織中可溶性蛋白質(zhì)的提取

準(zhǔn)備一齡、二齡、三齡、四齡、五齡長(zhǎng)翅芽和五齡短翅芽若蟲各10頭左右，連同上述成蟲樣品離心后所保留的沉淀，分別加入適量混有Protease Inhibitor Cocktail Set I(Merck公司)的RIPA裂解液后，用玻璃勻漿器冰浴勻漿30 min，4℃離心，所得上清即為組織中可溶性蛋白質(zhì)樣品。

1.4 SDS－PAGE 蛋白電泳

蛋白質(zhì)樣品按V(2×蛋白質(zhì)上樣緩沖液):V(蛋白質(zhì)樣品)=1∶1混勻，在沸水浴中煮沸5 min，12000 r/min離心5 min，小心取上清液20 μL上樣。先恒流15 mA 10 min，再升高到30 mA進(jìn)行電泳。電泳完畢后，進(jìn)行染色、脫色、拍照等，并利用BandScan軟件進(jìn)行掃描與半定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱成蟲SDS－PAGE可溶性蛋白電泳分析

褐飛虱成蟲可溶性蛋白電泳結(jié)果如圖1。其中圖1A圖為雄成蟲樣品電泳圖，共可觀察到30條比較清晰的條帶;圖1B圖為雌成蟲樣品電泳圖，則可觀察到31條條帶，其中條帶5為雌成蟲所特有，而其他條帶與雄成蟲的30條條帶一一對(duì)應(yīng)。該結(jié)果表明，褐飛虱與翅型或性別相關(guān)聯(lián)的特有的可溶性蛋白極少，多數(shù)蛋白條帶在長(zhǎng)、短翅型個(gè)體中或雌、雄個(gè)體中表現(xiàn)出的是含量上的差異，如條帶6在長(zhǎng)翅型雄蟲組織中的含量明顯高于在短翅型雄蟲組織的含量，而條帶2在長(zhǎng)翅型雌蟲血淋巴中的含量則明顯高于長(zhǎng)翅型雄蟲血淋巴的含量。

圖1 褐飛虱成蟲可溶性蛋白SDS－PAGE電泳圖Fig.1 The soluble protein of N.lugens adults on SDS－PAGE gelM:蛋白質(zhì)marker;Ⅰ:長(zhǎng)翅型雄蟲血淋巴;Ⅱ:短翅型雄蟲血淋巴;Ⅲ:長(zhǎng)翅型雄蟲組織提取的可溶性蛋白;Ⅳ:短翅型雄蟲組織提取的可溶性蛋白;Ⅴ:長(zhǎng)翅型雌蟲血淋巴;Ⅵ:短翅型雌蟲血淋巴;Ⅶ:長(zhǎng)翅型雌蟲組織提取的可溶性蛋白;Ⅷ:短翅型雌蟲組織提取的可溶性蛋白。差異明顯的條帶用阿拉伯?dāng)?shù)字 (1－11)標(biāo)出。

利用BandScan軟件對(duì)圖中標(biāo)出的1－11的蛋白條帶 (在不同翅型間或不同性別間含量差異較大)進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見表1。

條帶1、6、7、8的含量，長(zhǎng)翅型比短翅型高，應(yīng)與褐飛虱的翅型分化存在一定關(guān)聯(lián)。已有研究表明，長(zhǎng)翅型褐飛虱成蟲中保幼激素酯酶含量高，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到其相對(duì)分子質(zhì)量為66725，與條帶2的相對(duì)分子質(zhì)量接近，故推測(cè)條帶2可能為保幼激素酯酶，但其含量在兩種翅型的成蟲中差異并不明顯，尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。條帶1、2、3、7、8含量在雌、雄個(gè)體間存在明顯差異，其中條帶2、3、8在雌蟲體內(nèi)含量較高，而條帶1、7在雄蟲體內(nèi)含量較高。有趣的是條帶1、7、8在長(zhǎng)、短翅型間或雌、雄個(gè)體間含量均存在明顯差異，推測(cè)此類蛋白可能同時(shí)參與了翅型分化和性別分化的調(diào)控。條帶4在長(zhǎng)翅雄蟲中含量高于短翅雄蟲，然而長(zhǎng)翅雌蟲中含量卻低于短翅雌蟲，故此種蛋白對(duì)翅型分化的調(diào)控作用可能還與具體的性別有一定聯(lián)系。卵黃蛋白由3個(gè)亞基組成，相對(duì)分子質(zhì)量分別為44000、124500、148000［7］，與我們的條帶 9、10、11相對(duì)應(yīng)。從表1中發(fā)現(xiàn)，條帶9在長(zhǎng)、短雌雄成蟲中均有表達(dá)，且在含量上比較接近;條帶10在短翅型雄成蟲和長(zhǎng)、短雌成蟲中有表達(dá)，但在長(zhǎng)翅型雄成蟲未見明顯條帶，可能沒有表達(dá)或表達(dá)量極低;條帶11與條帶10類似，只在短翅型雄成蟲和長(zhǎng)、短雌成蟲中有表達(dá)，但在雌成蟲中的表達(dá)量明顯高于條帶9或10。

2.2 褐飛虱若蟲SDS－PAGE可溶性蛋白電泳分析

圖2是褐飛虱若蟲樣品電泳結(jié)果圖，1齡若蟲樣品只能辨別出3條條帶，隨著齡期升高，條帶逐漸增多，如3齡若蟲樣品有9個(gè)條帶，到5齡時(shí)則條帶數(shù)超過(guò)20條，與成蟲的條帶數(shù)接近。說(shuō)明褐飛虱生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，隨著結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜化，參與作用的蛋白種類愈來(lái)愈多。

圖2 褐飛虱各齡期若蟲可溶性蛋白SDS－PAGE電泳圖Fig.2 Analysis of the soluble proteins of N.lugens larvae by SDS－PAGEM:蛋白質(zhì)marker;1、2、3、4、5、6泳道分別為1齡若蟲、2齡若蟲、3齡若蟲、4齡若蟲、5齡長(zhǎng)翅芽若蟲、5齡短翅芽若蟲樣品;以字母A－G分別標(biāo)出比較明顯的條帶

利用BandScan軟件對(duì)圖中標(biāo)出的A－G蛋白條帶進(jìn)行半定量分析，結(jié)果見表2。在各齡期樣品中均以條帶E含量最高，預(yù)示該條帶有可能是儲(chǔ)存類蛋白;條帶A、B、C、D、E在各個(gè)齡期中均有表達(dá)，說(shuō)明褐飛虱在不同齡期的發(fā)育過(guò)程中均需要這些蛋白的參與，其中條帶A和E的相對(duì)分子質(zhì)量與褐飛虱卵黃蛋白的2個(gè)亞基相對(duì)分子質(zhì)量非常接近［7］，因此這2個(gè)條帶有可能是卵黃蛋白亞基。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)個(gè)別齡期具有特定的蛋白條帶，如F條帶只在5齡若蟲樣品中出現(xiàn)，而1－3齡若蟲樣品中未出現(xiàn)G條帶，直到4齡時(shí)樣品中才能檢測(cè)到。此外，我們還比較了5齡長(zhǎng)翅芽若蟲和短翅芽若蟲的可溶性蛋白差異，發(fā)現(xiàn)條帶B在長(zhǎng)翅芽若蟲樣品中的含量 (9.029 ng/μL)明顯高于短翅芽若蟲樣品中的含量 (5.133 ng/μL)，而長(zhǎng)翅芽若蟲樣品中的條帶G的含量則是短翅芽若蟲樣品中含量的3倍左右，說(shuō)明這2個(gè)條帶可能與翅型分化有關(guān)。

表1 褐飛虱成蟲可溶性蛋白差異條帶及其含量分析1)Table 1 The content analysis of differential bands of soluble proteins in N.lugens adults ng·μL－1

表2 褐飛虱若蟲可溶性蛋白差異條帶及其含量分析1)Table 2 The content analysis of differential bands of soluble proteins in N.lugens larvae ng·μL－1

3 討論

SDS－PAGE電泳法有操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但是存在著自身分辨率低等缺陷。所以，本研究雖然得到與性別和翅型兩性狀相關(guān)聯(lián)的差異條帶，仍很難確定這些差異條帶是否是單一蛋白。接下來(lái)的工作要通過(guò)雙向電泳等方法提高分辨率，找到單一的差異條帶，利于進(jìn)一步的分析。

對(duì)比不同翅型和性別樣品的電泳譜圖，我們獲得了與褐飛虱性別和翅型都存在著關(guān)聯(lián)的3條差異條帶，據(jù)此推測(cè)，褐飛虱中，性別和翅型的分化可能受到一些相同蛋白質(zhì)的調(diào)控，也預(yù)示這兩種型性間可能存在某些內(nèi)部聯(lián)系。在水稻害蟲預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)中，如能綜合考慮長(zhǎng)、短翅型比率和雌、雄性比這兩個(gè)方面的參數(shù)，應(yīng)可以提高褐飛虱種群數(shù)量預(yù)測(cè)的及時(shí)性和準(zhǔn)確性。

通過(guò)對(duì)褐飛虱各齡若蟲組織蛋白的分析，初步探討了若蟲發(fā)育過(guò)程中體內(nèi)蛋白的變化規(guī)律以及一些齡期的特有蛋白，研究結(jié)果有可能對(duì)今后進(jìn)一步深入研究若蟲發(fā)育調(diào)控蛋白提供幫助。

接下來(lái)的工作我們擬通過(guò)雙向電泳和質(zhì)譜等分析手段對(duì)褐飛虱可溶性蛋白進(jìn)行深入研究，從而確定與翅型或性別相關(guān)聯(lián)蛋白的具體性質(zhì)，以進(jìn)一步解析昆蟲多型形象的分子機(jī)制。

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