任廣彩，張 英，叢佩清，陳瑤生，何祖勇

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院//有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006;2.廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東廣州510642)

自20世紀(jì)80年代動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)出現(xiàn)以來，基因?qū)爰夹g(shù)已經(jīng)研究得較為深入，例如原核顯微注射、體細(xì)胞核移植、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、精子介導(dǎo)以及胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)等方法。雖然這些方法都存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)，但如何保證外源基因表達(dá)和遺傳的穩(wěn)定性仍是研究的關(guān)鍵內(nèi)容［1－4］。

大多情況下，外源基因的表達(dá)會(huì)隨著轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸降低;在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物傳代過程中，外源基因的表達(dá)也會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定性［2－3］。該現(xiàn)象的具體機(jī)制目前尚未研究清楚，但目前認(rèn)為整合到受體基因組中的外源基因的拷貝數(shù)和及其DNA甲基化修飾程度是影響其表達(dá)水平的兩個(gè)重要因素［5－6］。DNA甲基化是抑制基因轉(zhuǎn)錄的重要機(jī)制，存在著大量的可遺傳信息。DNA甲基化除了直接與轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合外，大多還需要通過與DNA甲基結(jié)合蛋白結(jié)合，引起基因沉默［7－9］。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)表明基因沉默可能與轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化相關(guān)［10－12］。CpG島主要分布在基因的5'端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)或者附近，一般位于管家基因和組織特異性基因的啟動(dòng)子和第1個(gè)外顯子區(qū)域［13］。DNA甲基化以后，其核苷酸序列沒有改變，但基因表達(dá)卻受到了影響，這是一種與基因活性開啟和關(guān)閉密切聯(lián)系的動(dòng)態(tài)過程［14］。位于啟動(dòng)子區(qū)的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)，這樣便于與轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合，但如果啟動(dòng)子區(qū)域處于甲基化狀態(tài)，轉(zhuǎn)錄因子不能與其結(jié)合，從而出現(xiàn)基因沉默。

另外，外源基因常常以多拷貝的形式整合到某一位點(diǎn)上，形成首尾相連的重復(fù)［15－17］，拷貝數(shù)越多，基因沉默就越嚴(yán)重，這可能是由于重復(fù)序列之間自發(fā)配對(duì)，甲基化酶識(shí)別這種結(jié)構(gòu)而將其甲基化［18］。2009年 Kong等［19］測(cè)定了轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞中外源基因的拷貝數(shù)，并用亞硫酸基因測(cè)序的方法來檢測(cè)CMV啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，外源基因的表達(dá)水平逐漸降低，啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度也隨著增大。然而外源基因表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化的關(guān)系在不同的研究報(bào)道得到的結(jié)果經(jīng)常是不一致的，而且在轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞中檢測(cè)外源基因甲基化的研究報(bào)道極少，因此本文采用亞硫酸鹽基因測(cè)序的方法來研究轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞中外源EGFP基因表達(dá)與CMV啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的關(guān)系，為評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源基因表達(dá)穩(wěn)定性提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

兩頭EGFP轉(zhuǎn)基因豬 (編號(hào)為318－4，364－2)為本實(shí)驗(yàn)室通過體細(xì)胞克隆方法獲得;成纖維細(xì)胞系源于兩頭轉(zhuǎn)基因豬的耳樣細(xì)胞所建系;pMD19-T Vector kit購自 Takara公司;EcoRⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購自NEB(New England Biolabs)公司;DMEM購自Sigma公司;Endo-free Plasmid Midi Kit、Gel Extraction Kit 和 Tissue DNA kit均購自O(shè)MEGA公司;EZ DNA Methylation-Gold Kit購自Zymo research。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度

豬成纖維細(xì)胞以105個(gè)/孔接種至24-well培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)收集細(xì)胞。流式檢測(cè)數(shù)目為10000個(gè)，細(xì)胞懸液不能少于300 μL。細(xì)胞必須經(jīng)過濾膜過濾以防儀器堵塞。用300目濾膜將細(xì)胞過濾到流式管中檢測(cè)。EGFP的激發(fā)光488 nm，發(fā)射光為500～543 nm，設(shè)為通道1。設(shè)EGFP熒光強(qiáng)度大于100的event為陽性，統(tǒng)計(jì)EGFP的陽性細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度。使用FlowJo 7.6.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 亞硫酸鹽處理及啟動(dòng)子區(qū)域PCR擴(kuò)增

分別取1 μg傳代至第3、10和15代的細(xì)胞提取的轉(zhuǎn)基因豬基因組用亞硫酸鹽處理 (根據(jù)EZ DNA Methylation-Gold Kit操作)，分析啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島(http://www.urogene.org/methprimer/)并用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)啟動(dòng)子區(qū)域的引物CMV-F和CMV-R(CMV-F 5'－ATAGTAATTAATTA CGGGGTTATTAGTT-3'，CMV-R 5'-CAACTCTACTT ATATAAACCTCCCAC-3')，PCR反應(yīng)條件:94℃，3 min;94℃，30 s;50℃，30 s;72℃，30 s;72℃，10 min;4℃，保存;40個(gè)循環(huán)。

1.4 酶切、連接和轉(zhuǎn)化

在w=1%瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，切下含有目的片段的凝膠，用OMEGA凝膠回收試劑盒進(jìn)行對(duì)應(yīng)片段的回收純化。凝膠回收的PCR產(chǎn)物，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，將PCR產(chǎn)物連接至T載 (pMD19-T Vector kit)。16℃過夜后，用Top10感受態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑單克隆搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和 HindⅢ進(jìn)行雙酶切檢測(cè)，將酶切檢測(cè)結(jié)果正確的10個(gè)質(zhì)粒送去測(cè)序。

1.5 CpG島的甲基化程度檢測(cè)

經(jīng)分析，CMV IE啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島共有30個(gè)，以亞硫酸鹽處理后的序列為標(biāo)準(zhǔn)序列與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì):

ATAGTAATTAATTACGGGGTTATTAGTTTATAGTTTATATATG GAGTTTCGCGTTATATAATTTACGGTAAATGGTTCGTTTGGTT GATCGTTTAACGATTTTCGTTTATTGACGTTAATAATGACGTA TGTTTTTATAGTAACGTTAATAGGGATTTTTTATTGACGTTAA TGGGTGGAGTATTTACGGTAAATTGTTTATTTGGTAGTATATT AAGTGTATTATATGTTAAGTACGTTTTTTATTGACGTTAATGA CGGTAAATGGTTCGTTTGGTATTATGTTTAGTATATGATTTTA TGGGATTTTTTTATTTGGTAGTATATTTACGTATTAGTTATCG TTATTATTATGGTGATGCGGTTTTGGTAGTATATTAATGGGC GTGGATAGCGGTTTGATTTACGGGGATTTTTAAGTTTTTATT TTATTGACGTTAATGGGAGTTTGTTTTGGTATTAAAATTAAC GGGATTTTTTAAAATGTCGTAATAATTTCGTTTTATTGACGT AAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTTTATATAAG TAGAGTTG。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化

實(shí)驗(yàn)選擇第5、10和15代轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞系 (364－2)進(jìn)行流式分析，觀察其熒光表達(dá)變化。從圖1可以看出，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，第10代細(xì)胞熒光強(qiáng)度較第5代變?nèi)酰钱?dāng)培養(yǎng)到第15代的時(shí)候，熒光強(qiáng)度又會(huì)變強(qiáng)。細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度如圖2(a)所示，第10代的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度低于500，而第5代和第15代的平均熒光強(qiáng)度超過1000。EGFP陽性熒光細(xì)胞的比例則沒有明顯的變化，均接近于100%，見圖2(b)。

圖1 流式分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化Fig.1 The variation of cell fluorescence intensity by flow cytometry analysis

圖2 細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度 (a)和熒光細(xì)胞的比例 (b)Fig.2 The mean fluorescence intensity(a)and the EGFP positive ratio(b)P5:第5代轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞;P10:第10代轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞;P15:第15代轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞

2.2 啟動(dòng)子CpG島甲基化程度檢測(cè)

將酶切鑒定正確的10個(gè)克隆送去測(cè)序，以亞硫酸鹽處理過的啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)序列，用Vector NTI軟件進(jìn)行序列比對(duì)，部分比對(duì)結(jié)果如圖3所示。胞嘧啶是否轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶可以表明此位點(diǎn)是否發(fā)生了甲基化，在測(cè)序結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，在一些非CpG島也有胞嘧啶沒有轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，說明這些非CpG島的胞嘧啶被甲基化了。在啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島總共有30個(gè)，在所分析的10個(gè)克隆中，CpG島的甲基化結(jié)果統(tǒng)計(jì)結(jié)果 (圖4)表明第5、10和15代細(xì)胞CMV啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島甲基化陽性率分別為3.64% ±1.25、2.97% ±1.03、1.65%±0.74，三代細(xì)胞間的甲基化陽性率差異不顯著 (P＞0.05)。

圖3 CMV IE啟動(dòng)子區(qū)域經(jīng)亞硫酸鹽處理后的部分比對(duì)序列Fig.3 A part of bisulfite sequence data for a representative region of CMV IE promoter

圖4 部分CpG島甲基化統(tǒng)計(jì)Fig.4 A part statistics of methylation at CpG sitesP5:第5代細(xì)胞;P10:第10代細(xì)胞;P15:第15代細(xì)胞

3 討論

目前對(duì)影響轉(zhuǎn)基因動(dòng)物外源基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響因素的研究比較少，本研究從外源基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的角度對(duì)轉(zhuǎn)基因豬中外源EGFP的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外傳代至第5、10和15代的轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞中EGFP熒光強(qiáng)度的變化情況，發(fā)現(xiàn)從第5代到第10代細(xì)胞熒光強(qiáng)度逐漸變?nèi)?，再培養(yǎng)到第15代時(shí)熒光強(qiáng)度又變強(qiáng)，并沒呈現(xiàn)隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，細(xì)胞熒光強(qiáng)度有逐漸變?nèi)醯内厔?shì)。該結(jié)果與Qingran Kong等［19］研究結(jié)果不一致，在他們研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬傳代細(xì)胞從20 d培養(yǎng)到90 d，外源基因EGFP的表達(dá)量逐漸降低，EGFP細(xì)胞的陽性也逐漸降低，該作者發(fā)現(xiàn)EGFP的拷貝數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸降低，啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增加，作者認(rèn)為啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平的增高是影響EGFP表達(dá)水平下降的主要影響因素。

通常認(rèn)為外源基因沉默是由于啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化引起的。在一些研究中已經(jīng)證明了啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化和基因表達(dá)成負(fù)相關(guān)［19－21］。本研究對(duì)CMV IE啟動(dòng)子區(qū)域的30個(gè)CpG島在不同時(shí)間點(diǎn)的甲基化情況進(jìn)行了分析，第10代細(xì)胞熒光強(qiáng)度變?nèi)酰鴨?dòng)子區(qū)域的CpG島的甲基化并沒有增加，與第5代的甲基化情況相同，第15代時(shí)甲基化程度反而有所減少，在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間而增加，也沒有發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子的甲基化會(huì)與基因表達(dá)有成負(fù)相關(guān)的聯(lián)系。兩者研究不一致的原因可能是外源基因在宿主基因組的整合位點(diǎn)不一樣。當(dāng)一個(gè)外源基因插入到異染色質(zhì)區(qū)域時(shí)，如端粒或者著絲粒區(qū)域，外源基因的表達(dá)有可能不穩(wěn)定，導(dǎo)致表達(dá)水平的不一樣。如果外源基因插入到能夠活躍表達(dá)的宿主基因區(qū)域內(nèi)，它可以促進(jìn)外源基因的表達(dá)。另外，外源基因和宿主本身基因之間的相互作用也影響著外源基因的表達(dá)，這種作用機(jī)制通常認(rèn)為是比較復(fù)雜的。甲基化情況可能與EGFP整合到宿主基因組的位點(diǎn)有關(guān)系，附近基因的表達(dá)也會(huì)調(diào)控外源基因的表達(dá)。

另外外源基因通常隨機(jī)整合到受體基因組中，高拷貝的隨機(jī)整合可能也是造成外源基因沉默的原因［17，20］。通常認(rèn)為外源基因是隨機(jī)整合到基因組中任何一個(gè)位點(diǎn)，但是也有學(xué)者認(rèn)為在基因組中有熱點(diǎn)整合位點(diǎn)［19］，整合到熱點(diǎn)位點(diǎn)的拷貝數(shù)越多，在傳代的過程中丟失的幾率性就越大。在體外CMV是一個(gè)很強(qiáng)的啟動(dòng)子［22］，但有些研究表明因?yàn)镈NA甲基化的原因CMV啟動(dòng)子在體內(nèi)也可呈沉默狀態(tài)［23－25］。另外EGFP作為一個(gè)外源基因，可能會(huì)受到機(jī)體免疫機(jī)制的影響對(duì)其進(jìn)行破壞或者清除。在外源基因進(jìn)行傳代和表達(dá)的時(shí)候受多種因素的影響，如拷貝數(shù)、甲基化、組蛋白的乙?；⒄{(diào)控因子、免疫機(jī)制等，但是否某一因素占主要地位或各種因素相互作用，還需要進(jìn)一步的研究。

從目前轉(zhuǎn)基因豬的耳組織細(xì)胞中EGFP的表達(dá)情況及甲基化的研究結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)基因豬中外源基因的表達(dá)相對(duì)來比較穩(wěn)定，啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度也沒有增高。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因豬成纖維細(xì)胞中外源EGFP的表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定，未受到沉默，可能與其CMV啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平較低，在傳代過程中甲基化水平并未增高有關(guān)。

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