鞠 豪 , 張全斌

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049;3. 中國(guó)科學(xué)院 海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

瓊膠是一種從石花菜屬(Gelidiumsp.)、江蘺藻屬(Gracilariasp.)、伊谷藻屬(Ahnfeltiasp.)、紫菜屬(Pyropia/Porphyraspp.)和雞毛菜屬(Plerocladiasp.)等紅藻的細(xì)胞壁中提取的天然水溶性高分子多糖物質(zhì)[1]。瓊膠主要由中性的瓊脂糖(agarose)和硫瓊膠(agaropectin) 組成。瓊脂糖是不含有硫酸基的非離子型線性半乳聚糖,由1, 3 連接的β-D-半乳糖和1, 4 連接的α-3, 6-內(nèi)醚半乳糖構(gòu)成的瓊二糖線性交替連接形成的共聚物,具有凝膠功能[2]; 硫瓊膠[3]是瓊膠中部分硫酸化的復(fù)雜多糖且不具有凝膠功能。瓊脂糖具有相對(duì)較低的電內(nèi)滲作用并且不吸附堿性染料和蛋白質(zhì), 常用于電泳[4]和色譜法[5]。同時(shí), 瓊脂糖因具有良好的物理、化學(xué)和熱穩(wěn)定性而廣泛用于多糖等活性物質(zhì)的分離[5]、組織工程、填充劑、藥物輸送、染料吸附、重金屬吸附、生物分子吸附和水中多環(huán)芳烴的測(cè)定[6]。

目前, 瓊脂糖制備方法很多。根據(jù)分離原理, 這些方法可大致分為硫瓊膠沉淀法[7]、瓊脂糖沉淀法[8]、離子交換法[9]、離子液體[10]等方法。DEAE-纖維素法[9]制備的瓊脂糖品質(zhì)優(yōu)良, 其硫酸基含量較低且凝膠強(qiáng)度較高, 適用于生物技術(shù)級(jí)瓊脂糖的生產(chǎn), 然而DEAE-纖維素的高昂價(jià)格限制了其工業(yè)應(yīng)用。乙?；╗11]制備瓊脂糖存在乙酰化過(guò)程中部分瓊脂糖降解的缺陷。季銨沉淀法[11]制備瓊脂糖的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)形成乳狀沉淀, 該沉淀很難通過(guò)離心、過(guò)濾、加熱從瓊脂糖溶液中分離純化出來(lái)。聚乙二醇法[8]制備的瓊脂糖具有相對(duì)較高的凝膠強(qiáng)度和較小的電內(nèi)滲值, 但是聚乙二醇在制備過(guò)程中還可以吸附色素導(dǎo)致瓊脂糖著色, 使瓊脂糖產(chǎn)品呈現(xiàn)出淡黃或微黃色。尿素法、EDTA-Na2螯合法和磷酸鈉法[6]在制備過(guò)程中引入了新的雜質(zhì)導(dǎo)致瓊脂糖產(chǎn)品純度較低。考慮到當(dāng)前這些方法的局限性, 開(kāi)發(fā)制備瓊脂糖的新方法很有必要。采用聚丙烯酰胺-樹(shù)脂聯(lián)合法制備瓊脂糖, 目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過(guò)單因素試驗(yàn)確定聚丙烯酰胺-樹(shù)脂聯(lián)合法從江蘺瓊膠中分離精制瓊脂糖的最佳工藝條件,為開(kāi)發(fā)瓊脂糖制備新方法提供參考。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

H-2K4 恒溫四孔水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司); 凝膠強(qiáng)度儀(中國(guó)科學(xué)院海洋研究所);CIC-D100 型離子色譜儀(青島盛瀚色譜技術(shù)有限公司); Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet IS10 FT-TR)。

江蘺瓊膠, 由綠新(福建)食品有限公司提供; 聚丙烯酰胺(AR 200-1400 萬(wàn)陽(yáng)離子), 購(gòu)于山東西亞試劑; 鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、D-果糖均為分析純, 購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑; 間苯二酚、1, 1-乙縮醛均為分析純, 購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂, 購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 瓊脂糖制備方法

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn), 綜合考慮制備效果和成本, 我們選擇聚丙烯酰胺和弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。我們通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂的反應(yīng)工藝進(jìn)行確定。

將活化后的弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂加入到1%(w/w)的瓊膠溶液中。將混合物在一定溫度下攪拌一定時(shí)間。反應(yīng)完成后, 立即將熱混合物過(guò)濾,然后將濾液置于室溫下以形成凝膠, 將得到的凝膠冷凍干燥并粉碎, 得到白色瓊脂糖粉末。選取對(duì)弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂制備瓊脂糖的主要指標(biāo)有顯著影響的3 個(gè)因素(樹(shù)脂使用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度)進(jìn)行單因素試驗(yàn), 主要指標(biāo)為硫酸基含量,在反應(yīng)過(guò)程中兼顧產(chǎn)品的白度, 從而確定各單因素的最優(yōu)水平。

(1) 弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂添加量：固定反應(yīng)溫度80℃、反應(yīng)時(shí)間150 min、瓊膠溶液濃度為1%, 選取2︰1、1︰1、1︰2、1︰3、1︰4、1︰5等6 個(gè)不同的瓊膠與弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂質(zhì)量比進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

(2) 弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂的反應(yīng)時(shí)間：固定瓊膠原料與弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂質(zhì)量比為1︰3、反應(yīng)溫度80℃、瓊膠溶液濃度為1%, 選取60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min 等6 個(gè)不同的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

(3) 弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂的反應(yīng)溫度：固定瓊膠與弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂質(zhì)量比為1︰3、反應(yīng)時(shí)間150 min、瓊膠溶液濃度為1%, 選取50℃、60℃、70℃、80℃、90℃等5 個(gè)不同的反應(yīng)溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.2 瓊脂糖理化性質(zhì)測(cè)定

(1) 凝膠強(qiáng)度測(cè)定 參照GB1975-2010 和王曉龍等人的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。稱取適量(扣除水分后計(jì)算所得的試樣量, 精確至0.001 g)樣品加入適量的蒸餾水, 室溫下溶脹2 h, 加熱配制1.5%的瓊脂糖溶液。趁熱分別倒入稱量瓶中, 待冷卻凝固后置于4℃冰箱中過(guò)夜, 30℃水浴鍋恒溫60 min 使凝膠穩(wěn)定,然后用凝膠強(qiáng)度儀測(cè)定凝膠強(qiáng)度, 取平均值[12-13]。

(2) 硫酸基測(cè)定 采用離子色譜法測(cè)定瓊脂糖樣品中的硫酸基含量[14]。稱取0.1 g 左右粉碎的瓊脂糖粉末放入安瓿瓶中, 加入8 mL 2 mol/L 的鹽酸, 室溫溶脹2 h, 封管, 105℃下水解4 h, 冷卻至室溫, 用氫氧化鈉溶液中和至pH 為6～7, 過(guò)濾, 定容至50 mL。離子色譜法測(cè)定硫酸基含量, 采用SH-AC-1型陰離子色譜柱, 淋洗液組成為4.5 mmol/L 的NaHCO3溶液和3.6 mmol/L 的Na2CO3溶液, 流速為1.5 mL/min。

(3) 水分測(cè)定 參照GB5009.3-2010 的方法測(cè)定水分[15]。稱取適量的瓊脂糖粉末放入已經(jīng)干燥至恒重的稱量瓶中105℃干燥至恒重。

(4) 透明度測(cè)定 取瓊脂糖樣品配制成1%溶液, 將熱膠液(大于95℃)倒入比色皿中, 室溫放置24 h, 用紫外分光光度計(jì)在400～800 nm 間掃描, 確定最大吸收波長(zhǎng)700 nm, 在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的透光率(T)[16]。

(5) 融化溫度和凝固溫度 稱取適量瓊脂糖在沸水中溶解制成1.5%的瓊脂糖溶液, 取5.0 mL 溶液裝入試管中, 于2～4℃冰箱內(nèi)冷卻過(guò)夜, 在凝膠表面放置一個(gè)小鋼珠, 將試管置于30℃水浴中, 待膠體穩(wěn)定后在以每分鐘升高1℃的速度升溫, 當(dāng)小鋼珠從凝膠表面下落時(shí), 此刻的溫度即為融化溫度[17]。配制1.5%的瓊脂糖溶液, 室溫下使瓊脂糖溶液的溫度以每分鐘降低1℃的速度降低, 待試管內(nèi)凝膠凝固, 即傾斜試管傾斜90℃時(shí), 凝膠表面能保持不變且抽出溫度計(jì)凝膠表面不變形, 此刻的溫度即為凝固溫度[17]。

(6) 紅外光譜 將干燥的瓊脂糖樣品粉末, 壓片,利用Nicolet Is10 傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定。

(7) 白度測(cè)定 將干燥的瓊脂糖樣品粉末置于研缽研磨后, 利用CR-400/410 色彩色差計(jì)進(jìn)行測(cè)定,待示數(shù)穩(wěn)定時(shí), 記錄此時(shí)的數(shù)值即為樣品的白度。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。使用SPSS 19.0 版使用單向方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在P<0.05 時(shí), 結(jié)果被認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖制備工藝

硫酸基含量是決定瓊脂糖質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)。本研究采用江蘺瓊膠為原料, 瓊膠硫酸基含量為1.27%(表1)。在前期研究中, 我們通過(guò)單因素試驗(yàn)獲得聚丙烯酰胺法制備瓊脂糖的最優(yōu)工藝。在60℃下,0.8%(w/w)的聚丙烯酰胺溶液以料液比1︰4 的比例加入瓊膠溶液中反應(yīng)120 min。此條件下制備的瓊脂糖硫酸基含量為0.4%, 較瓊膠硫酸基含量降低了2/3以上, 但在此條件下制備的瓊脂糖硫酸基的含量仍然較高, 還有繼續(xù)降低的必要性。

表1 瓊脂和瓊脂糖的理化特性Tab. 1 Physicochemical properties of agar and agarose

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中, 我們發(fā)現(xiàn)用弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂處理瓊膠可以降低其硫酸基含量。因此,我們通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化其制備工藝。如圖1 所示,所得瓊脂糖硫酸基含量隨樹(shù)脂使用量的增加而降低,即硫酸基含量由瓊膠原料的1.27%減少到0.74%(瓊膠與樹(shù)脂質(zhì)量比為2︰1), 再減少到0.32%(瓊膠與樹(shù)脂質(zhì)量比為1︰3), 此后硫酸基含量并不會(huì)隨著樹(shù)脂用量的增加而降低, 反而趨于穩(wěn)定。該結(jié)果表明瓊膠中帶負(fù)電的硫酸基已經(jīng)被陰離子樹(shù)脂充分吸附, 再增加樹(shù)脂的使用量對(duì)硫酸基吸附效果并不明顯, 因而樹(shù)脂使用量最終確定為瓊膠與樹(shù)脂質(zhì)量比為1︰3。

圖1 樹(shù)脂法中樹(shù)脂使用量對(duì)瓊脂糖硫酸基含量的影響Fig. 1 Effect of resin usage on the agarose sulfate content in the resin method

圖2 顯示了反應(yīng)時(shí)間對(duì)瓊脂糖硫酸基含量的影響。120 min 以前, 瓊脂糖硫酸基含量下降趨勢(shì)比較明顯, 硫酸基含量從瓊膠原料的1.27%迅速下降到0.35%, 120 min 以后硫酸基含量下降開(kāi)始放緩, 直至150 min 以后, 硫酸基含量趨于穩(wěn)定, 穩(wěn)定在0.32%。因而, 150 min 是獲得瓊脂糖的最佳時(shí)間。

圖2 樹(shù)脂法中反應(yīng)時(shí)間對(duì)瓊脂糖硫酸基含量的影響Fig. 2 Effect of reaction time on the agarose sulfate content in the resin method

反應(yīng)溫度對(duì)硫酸基含量的影響如圖3 所示, 當(dāng)溫度從50℃升高到80℃時(shí), 所得瓊脂糖硫酸基含量總體呈現(xiàn)出下降趨勢(shì), 硫酸基含量從0.55%降低至0.32%。隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)增加, 硫酸基含量反而呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)?？紤]反應(yīng)溫度對(duì)硫酸基含量的影響, 我們選取80℃為最佳反應(yīng)溫度。

因此弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂法的最佳反應(yīng)條件為: 在80℃下, 瓊膠原料與樹(shù)脂質(zhì)量比為1︰3的弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂在瓊膠溶液中反應(yīng)150 min。

圖3 樹(shù)脂法中反應(yīng)溫度對(duì)瓊脂糖硫酸基含量的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on agarose sulfate content in resin method

單用弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂或聚丙烯酰胺處理時(shí), 兩者都只能除掉瓊膠中大部分硫瓊膠,為了提高硫瓊膠脫除效率, 我們將聚丙烯酰胺和弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂聯(lián)合使用。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果, 確定的聯(lián)合處理反應(yīng)條件為: 0.8%(w/w)聚丙烯酰胺溶液以料液比為 1︰4 的比例加入到1%(w/w)的瓊膠溶液中, 在60℃下攪拌120 min, 反應(yīng)完成后, 立即將熱混合物過(guò)濾, 然后將瓊膠原料3倍質(zhì)量的樹(shù)脂加入到濾液中, 在80℃下攪拌150 min,趁熱過(guò)濾, 將濾液置于室溫下以形成凝膠, 將凝膠冷凍干燥并粉碎, 得到白色瓊脂糖粉末。在此條件下,所得到的瓊脂糖的硫酸基含量為0.22%, 較單獨(dú)處理時(shí)有較大改善, 表明該方法能夠用于制備瓊脂糖。

2.2 瓊脂糖的理化性質(zhì)

在聯(lián)用法最佳工藝下, 我們進(jìn)行3 個(gè)批次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)來(lái)制備瓊脂糖并測(cè)定了處理前后樣品的凝膠強(qiáng)度、硫酸基含量、水分、透明度、融化溫度、凝固溫度和白度。如表1 所示, 瓊膠和瓊脂糖的硫酸基含量分別為1.27%和0.22%, 這表明該方法可以有效地去除硫瓊膠。瓊脂糖的凝膠強(qiáng)度為1 523.7 g/cm2, 凝固溫度為39.7℃, 融化溫度為87.6℃。與瓊膠原料相比, 瓊脂糖的凝膠強(qiáng)度和白度顯著提高，硫酸基含量顯著降低, 表明該方法可以用于瓊脂糖的生產(chǎn)。

從圖4 中可以看出, 自制江蘺瓊脂糖與Biowest瓊脂糖兩者的紅外圖譜幾乎重合且主要特征吸收峰相似, 表明兩種瓊脂糖的主要成分和官能團(tuán)種類基本相同。兩者在3 354 cm–1、2 898 cm–1、1 400～1 200 cm–1、1 200～1 000 cm–1處都有多糖特征性的吸收峰存在,1 150 cm–1為C-O 的伸縮振動(dòng)及O-H 變形振動(dòng)峰,3 000 cm–1附近的峰為環(huán)內(nèi)C-H 的信號(hào)峰, 3 400 cm–1左右處的吸收峰為-OH 的信號(hào)峰, 這些吸收峰的存在表明瓊脂糖是一種糖類化合物; 同時(shí), 譜圖在820～851 cm–1附近沒(méi)有特征峰, 該結(jié)果表明D-半乳糖在C4 和C6 位上面沒(méi)有直鍵硫酸基的存在; 在930 cm–1處的吸收峰為3, 6-內(nèi)醚半乳糖的特征吸收峰并且較尖銳, 表明3, 6-內(nèi)醚半乳糖含量較高; 1 250 cm–1處為總硫的特征吸收, 譜圖顯示此處沒(méi)有吸收峰, 表明自制瓊脂糖的總硫含量很低; 1 369 cm–1有較弱的C=O 的對(duì)稱吸收峰, 此峰是瓊脂糖中羥基化的特征吸收峰[18]。

圖4 Biowest 瓊脂糖和自制瓊脂糖的紅外光譜Fig. 4 Infrared spectra of Biowest agarose and self-made agarose

3 討論

瓊脂糖制備技術(shù)的關(guān)鍵在于將瓊膠中的硫瓊膠與瓊脂糖分離開(kāi)來(lái)并盡可能地降低瓊脂糖中硫酸基等帶電基團(tuán)的含量。在本研究中, 我們成功地通過(guò)聚丙烯酰胺-弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂聯(lián)合法將硫瓊膠從瓊膠中分離出來(lái), 從而獲得瓊脂糖。瓊脂糖的質(zhì)量主要取決于凝膠強(qiáng)度和硫酸基含量。瓊脂糖硫酸基含量的多少直接決定了瓊脂糖的用途, 因此本試驗(yàn)以硫酸基含量為指標(biāo)對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

在制備過(guò)程中, 瓊脂糖硫酸基的含量隨著弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂添加量的增加而呈現(xiàn)出先降低后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。這可能因?yàn)殡S著弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂用量的增加, 陰離子交換樹(shù)脂的離子交換容量增大, 瓊膠溶液中的硫瓊膠部分被陰離子交換樹(shù)脂充分吸附, 制備的瓊脂糖硫酸基含量越來(lái)越低, 當(dāng)瓊膠原料與陰離子交換樹(shù)脂的質(zhì)量比為1︰3 時(shí), 陰離子交換樹(shù)脂的交換能力可以滿足瓊膠溶液中以硫酸基為主的帶負(fù)電基團(tuán)的交換吸附, 瓊膠中的硫瓊膠被充分吸附, 再增加陰離子交換樹(shù)脂的質(zhì)量對(duì)硫酸基吸附量增加效果不明顯。在反應(yīng)過(guò)程中, 隨著時(shí)間的增加, 瓊脂糖硫酸基的含量也呈現(xiàn)出先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。這種變化出現(xiàn)的原因可能是反應(yīng)剛開(kāi)始時(shí)提取時(shí)間的增加,陰離子交換樹(shù)脂對(duì)膠液中的硫瓊膠吸附增多, 繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間, 硫瓊膠大部分被吸附而使反應(yīng)趨于平衡, 陰離子交換樹(shù)脂不會(huì)在對(duì)硫瓊膠進(jìn)行吸附,因而自制瓊脂糖的硫酸基含量也就趨于穩(wěn)定。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)自制瓊脂糖的硫酸基含量隨反應(yīng)溫度的不同整體上呈現(xiàn)出接近V 型變化, 即先下降后上升。在瓊膠溶液溫度較低時(shí), 瓊膠溶液流動(dòng)性較差, 溶液的黏稠性會(huì)阻礙硫瓊膠與陰離子交換樹(shù)脂離子交換的進(jìn)行。隨著反應(yīng)溫度的升高, 瓊膠溶液的黏度減小, 溶液中樹(shù)脂和瓊膠的混合更加均勻, 兩者可以充分接觸, 使得離子交換吸附可以進(jìn)行完全, 因而可以獲得硫酸基含量比較低的瓊脂糖。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí), 過(guò)高的溫度會(huì)對(duì)陰離子交換樹(shù)脂的活性基團(tuán)產(chǎn)生影響, 樹(shù)脂本身的結(jié)構(gòu)也可能會(huì)遭到破壞[19]。這些因素會(huì)對(duì)反應(yīng)過(guò)程造成影響, 使得樹(shù)脂的使用效率降低, 自制瓊脂糖的硫酸基含量升高, 同時(shí), 過(guò)高的溫度也會(huì)使已被交換吸附至陰離子交換樹(shù)脂上的硫瓊膠重新溶解于過(guò)熱的瓊膠溶液中, 從而對(duì)自制瓊脂糖硫酸基含量產(chǎn)生影響。因而80℃是弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂的最佳反應(yīng)溫度。

戚勃等人[20]通過(guò)KMnO4-H2C2O4法對(duì)瓊脂糖進(jìn)行漂白, 其白度達(dá)到92.72。盡管該漂白方法在反應(yīng)過(guò)程中最大程度的保護(hù)了瓊脂糖的凝膠強(qiáng)度, 但反應(yīng)過(guò)程中的酸性環(huán)境仍然對(duì)瓊脂糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞,導(dǎo)致了其凝膠強(qiáng)度的降低。孫寧等人[16]用聚乙二醇法制備的瓊脂糖透明度高, 但是聚乙二醇也會(huì)吸附色素等可溶性雜質(zhì), 導(dǎo)致瓊脂糖白度降低。在本研究中, 自制瓊脂糖白度和透明度分別達(dá)到 88.32%±0.04%和58.88%±3.0%。反應(yīng)過(guò)程中聚丙烯酰胺可以有效地吸附瓊膠中硫酸基等帶電基團(tuán)且部分可溶性雜質(zhì)也被吸附, 從而提高了瓊脂糖的透明度和白度。同時(shí), 弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂也可以有效吸附瓊膠中帶有硫酸基等荷電基團(tuán)的物質(zhì), 從而獲得中性的瓊脂糖。因此, 該方法適用于瓊脂糖的制備。由于不需要額外的漂白過(guò)程, 因此該方法可以減少化學(xué)試劑的使用, 簡(jiǎn)化反應(yīng)步驟并降低生產(chǎn)成本。

凝膠強(qiáng)度是瓊脂糖質(zhì)量的重要參數(shù)。瓊脂糖的凝膠強(qiáng)度受許多因素影響, 并與其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[21]。我們發(fā)現(xiàn)自制瓊脂糖的凝膠強(qiáng)度略低于Sigma 低電泳瓊脂糖的凝膠強(qiáng)度。其原因可能是在瓊膠溶解過(guò)程中, 加熱解可能會(huì)導(dǎo)致瓊膠輕微的降解,同時(shí)樹(shù)脂法中, 瓊膠需要在80℃下反應(yīng)150 min, 長(zhǎng)時(shí)間的攪拌和加熱也會(huì)造成瓊脂糖的部分降解。雖然發(fā)生了降解, 但是硫瓊膠的除去使瓊脂糖凝膠強(qiáng)度仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于瓊膠原料, 表明該方法可以適用于瓊脂糖的制備。Araki 等人[2]認(rèn)為在瓊脂糖制備過(guò)程中很難完全去除硫酸根基團(tuán)。與原料相比, 研究中瓊脂糖的硫酸基含量降低80%以上。達(dá)到了瓊脂糖的基本要求。

4 結(jié)論

本研究采用的聚丙烯酰胺是日常生活中用于污水處理的常見(jiàn)的絮凝劑, 價(jià)格低廉且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染; 弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂是工業(yè)生產(chǎn)中常見(jiàn)的樹(shù)脂, 與DEAE-纖維素相比, 其價(jià)格低廉且可以重復(fù)使用。因此, 該方法整個(gè)制備過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單且便宜、試劑消耗量少、反應(yīng)時(shí)間短、操作方便、不同批次產(chǎn)品之間差異性較小。但是目前該制備方法僅實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室級(jí)小批量制備, 未來(lái)我們將進(jìn)行中試放大生產(chǎn), 確定大批量制備的工藝條件,從而最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)。

在本研究中, 我們以從江蘺中獲得的商業(yè)瓊脂用作原料, 通過(guò)聚丙烯酰胺-弱堿性苯丙烯系陰離子交換樹(shù)脂法制備的瓊脂糖硫酸基含量為0.22%、凝膠強(qiáng)度為1 524 g/cm2、透明度為58.9%, 凝固溫度為39.7℃、融化溫度為87.6℃。其凝膠強(qiáng)度與Sigma瓊脂糖(A4679, 凝膠強(qiáng)度≥1 200 g/cm2)相當(dāng)。與瓊膠原料相比, 自制瓊脂糖具有高凝膠強(qiáng)度、低硫酸基含量、高透明度和高白度等多種優(yōu)點(diǎn), 其各項(xiàng)指標(biāo)滿足了普通級(jí)瓊脂糖的要求。因此, 本研究建立了一種新的、簡(jiǎn)單、快速、污染少的聯(lián)合方法, 以從江蘺瓊膠中制備瓊脂糖。