葉迎等

摘要：目的 分別建立秦皮提取物總香豆素和4種主要香豆素成分紫外分光光度法（UV）和高效液相色譜法（HPLC）含量測定方法。方法 采用UV，以秦皮甲素為對照品，在334 nm測定秦皮提取物總香豆素的含量；采用HPLC，用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.01%磷酸溶液為流動相梯度洗脫，在334 nm測定秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素4種主要香豆素成分的含量。結(jié)果 秦皮甲素的質(zhì)量濃度在5.76～23.04 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為100.6%（RSD=1.8%）；4種香豆素成分秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的質(zhì)量分別在0.055 0～3.850 0 μg（r=0.999 7）、0.053 9～3.773 0 μg（r=0.999 8）、0.060 0～0.660 0 μg（r=0.999 9）、0.056 2～0.618 2 μg（r=0.999 9）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為96.97%（RSD=1.26%）、100.80%（RSD=2.22%）、99.04%（RSD=2.47%）、98.77% （RSD=1.94%）。結(jié)論 2種含量測定方法簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于秦皮提取物總香豆素和主要香豆素成分的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：秦皮提取物；香豆素；紫外分光光度法；高效液相色譜法；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.023

中圖分類號：R284.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）08-0083-05

Study on Content Determination of Coumarin in Fraxini Cortex Extract YE Ying1， BAI Dong1， BAO Qiang2， WANG Rui-hai1， LIU Li-mei1 （1.Institute of Basic Theory Research of TCM， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；2.Gansu Province Hospital of TCM， Lanzhou 730050， China）

Abstract：Objective To establish a UV spectrophotometry method and an HPLC method respectively for the determination of the total content of coumarin and contents of four main constituents of coumarin in Fraxini Cortex extract. Methods UV spectrophotometry was used for the determination of the content of total coumarin in Fraxini Cortex extract. The reference substance was Aesculin， and the maximum ultraviolet absorption wavelength was 334 nm. The HPLC method was used to determine the contents of Aesculin， Fraxin， Aesculetin and Fraxetin in Fraxini Cortex extract， using gradient elution with acetonitrile-phosphate solution （0.01%） as mobile phase on Agilent ZORBAX SB-C18 chromatographic column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） at room temperature. Results For the UV method， the linear range of the mass concentration of Aesculin was 5.76-23.04 μg/mL （r=0.999 9）， and the average recovery was 100.6% （RSD=1.8%）. For the HPLC method， the linear ranges of the mass of Aesculin， Fraxin， Aesculetin and Fraxetin were 0.055 0-3.850 0 μg （r=0.9997）， 0.053 9-3.773 0 μg （r=0.999 8）， 0.060 0-0.660 0 μg （r=0.999 9）， and 0.056 2-0.618 2 μg （r=0.999 9）， respectively， and the average recoveries were 96.97% （RSD=1.26%）， 100.80% （RSD=2.22%）， 99.04% （RSD=2.47%）， and 98.77% （RSD=1.94%）， respectively. Conclusion Both of the two methods are simple， accurate and reliable， and can be used for the quality control of total coumarin and the main constituents of coumarin in Fraxini Cortex extract.

Key words：Fraxini Cortex extract；coumarin；UV spectrophotometry；HPLC；content determination

基金項目：中國中醫(yī)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費自主選題項目（YZ-1411）

通訊作者：劉麗梅，E-mail：liulimeihrb@sina.com

秦皮，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定秦皮為木犀科植物苦櫪白蠟樹Fraxinus rhynchophylla Hance、白蠟樹F.chinensis Roxb.、尖葉白蠟樹F.szaboana Lingelsh.或宿柱白蠟樹F.stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮。研究表明，秦皮的主要有效成分為香豆素類化合物[1]。藥理研究發(fā)現(xiàn)，秦皮提取物能夠保護小鼠急性肝損傷[2]，對輻射所致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有明顯的抑制作用[3]，對大鼠實驗性脂肪肝有一定治療作用[4]。目前對于秦皮藥材中香豆素類成分的含量測定方法已有報道[5-6]，而秦皮提取物中總香豆素和主要香豆素成分含量測定方法未見報道。本實驗室從秦皮藥材中提取分離出6種香豆素類成分[7-9]，其中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素含量較高[10]。為此，本研究分別采用紫外分光光度法（UV）和高效液相色譜法（HPLC），以秦皮總香豆素和4種主要香豆素成分為質(zhì)量控制指標(biāo)，建立秦皮提取物含量測定方法，為秦皮的深入研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國安捷倫）， Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m，美國安捷倫），8453紫外-可見分光光度計（美國安捷倫），CX-250超聲波清洗機（天海雙龍醫(yī)療設(shè)備有限公司），CP2202S電子天平（瑞士梅特勒-托利多）。

秦皮提取物為中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所中藥分析實驗室自制，分別為苦櫪白蠟樹枝皮采用75%乙醇提取的醇提取物，以及水煎煮提取的水提取物。秦皮甲素、秦皮乙素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110741-200506、110740- 200104；秦皮苷（HPLC純度>98%）、秦皮素（HPLC純度>98%）為中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所中藥分析實驗室自制。乙腈為色譜純（Fisher公司），其他試劑為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 總香豆素含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取秦皮甲素對照品1.44 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為288 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取秦皮醇提取物10 mg，精密稱定，置錐形瓶中，精密加甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率200 Hz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 測定波長的選擇 取秦皮甲素對照品溶液和“2.1.2”項下供試品溶液，以甲醇為空白，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）分光光度法，在200～500 nm進行掃描，光譜圖見圖1。由圖可見，對照品溶液和供試品溶液在334 nm處均有最大吸收，故選擇334 nm作為測定波長。

A

B

注：A.對照品；B.供試品

圖1 秦皮提取物及秦皮甲素光譜圖

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“2.1.1”項下秦皮甲素對照品溶液0.20、0.35、0.50、0.65、0.80 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，以甲醇為空白，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）分光光度法，在334 nm波長處測定吸光度，結(jié)果分別為0.211、0.365、0.531、0.686、0.857。以吸光度為縱坐標(biāo)，秦皮甲素濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.037 3C-0.007 7， r=0.999 9（n=5），表明秦皮甲素在5.76～23.04 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察 精密量取“2.1.4”項下對照品溶液（14.40 μg/mL），以甲醇為空白，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）分光光度法，在334 nm波長處測定吸光度，連續(xù)測定6次，結(jié)果分別為0.548、0.535、0.522、0.535、0.539、0.532。對照品溶液在334 nm處吸光度平均值為0.535，RSD=1.6%（n=6），說明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 精密稱定秦皮醇提物10.01 mg，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。以甲醇為空白，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）分光光度法，分別于0、2、4、6、8 h在334 nm波長處測定吸收度，結(jié)果分別為0.398、0.405、0.392、0.394、0.406。供試品溶液在334 nm處吸光度平均值為0.399， RSD=1.6%，說明供試品溶液8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性考察 取同一批次的秦皮醇提取物樣品約10 mg，共6份，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，以甲醇為空白，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）分光光度法，在334 nm波長下測定吸光度，結(jié)果分別為0.421、0.409、0.412、0.394、0.399、0.413，RSD=1.5%（n=6），說明本方法重復(fù)性良好。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總香豆素的平均含量為21.7%。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批號已知含量樣品6份（總香豆素含量為21.7%）各5.0 mg，置量瓶中，分別加入1.036 8 mg秦皮甲素（0.288 mg/mL秦皮甲素對照品溶液3.6 mL），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）分光光度法，在334 nm波長處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中總香豆素的含量，計算總香豆素回收率，結(jié)果見表1。平均回收率為100.6%，RSD=1.8%（n=6），說明本方法準(zhǔn)確性良好。

2.1.9 樣品測定 取秦皮醇提取物、水提取物樣品各3份，約10 mg，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按2010年版《中華人民共和國藥典》（一部）分光光度法，在334 nm波長處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品中總香豆素的含量，結(jié)果見表2。

2.2 4種主要香豆素成分含量測定

2.2.1 色譜條件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m），以乙腈（A）-0.01%磷酸（B）為流動相梯度洗脫（0～21 min，8%～15%A；21.0～21.1 min，15%～80%A；21.1～25 min，80%A）；柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長334 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解，定容，得濃度分別為0.550 0、0.539 0、0.060 0、0.056 2 mg/mL的4種成分對照品溶液；另精密稱取上述4種對照品適量，加甲醇配制成含秦皮甲素0.197 9 mg/mL、秦皮苷0.186 6 mg/mL、秦皮乙素0.010 8 mg/mL、秦皮素0.049 mg/mL的溶液，作為混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取秦皮提取物適量，粉碎，過80目篩，精密稱取10 mg，加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲40 min（功率250 W，頻率200 Hz），放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察 精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各8 μL進樣分析，色譜圖見圖2?？梢?，在該色譜條件下，空白溶劑沒有影響，可以將秦皮中4種香豆素成分檢測出來，專屬性良好。

A

B

C

注：A.對照品；B.供試品；C.空白溶劑；

1.秦皮甲素；2.秦皮苷；3.秦皮乙素；4.秦皮素

圖2 秦皮提取物中4種主要香豆素成分HPLC圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取秦皮甲素對照品溶液（0.550 0 mg/mL）0.1、0.5、1.5、3、5、7 ?L，秦皮苷對照品溶液（0.539 0 mg/mL）0.1、0.5、1.5、3、5、7 ?L，秦皮乙素對照品溶液（0.060 0 mg/mL）1、3、5、7、9、11 ?L，秦皮素對照品溶液（0.056 2 mg/mL）1、3、5、7、9、11 ?L，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。Y秦皮甲素=2111.7X+71.454，r=0.9997，表明秦皮甲素在0.055 0～3.850 0 ?g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；Y秦皮苷=1563.5X-4.7342，r=0.9998，表明秦皮苷在0.053 9～3.773 0 ?g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；Y秦皮乙素=3313X+7.608， r=0.999 9，表明秦皮乙素在0.060 0～0.660 0 ?g范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系；Y秦皮素=3122.7X+13.715，r=0.999 9，表明秦皮素在0.056 2～0.618 2 ?g范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液（含秦皮甲素0.197 9 mg/mL、秦皮苷0.186 6 mg/mL、秦皮乙素0.010 8 mg/mL、秦皮素0.014 9 mg/mL）8 μL，在所確定的色譜條件下，重復(fù)進樣6次，計算秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素峰面積RSD分別為0.12%、0.19%、0.74%、0.25%，說明本法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液8 μL，分別于0、2、4、6、8、12 h依次進樣，計算各成分含量及其RSD。結(jié)果秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素平均含量分別為18.667 7%（RSD=0.780 7%）、16.814 5%（RSD=1.478 5%）、1.027 8%（RSD=1.779 9%）、1.406%（RSD=1.549 4%），說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品按供試品制備6份供試品溶液，分別精密吸取8 μL進樣分析，計算各成分含量及其RSD。結(jié)果秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素平均含量分別為19.250 9%（RSD=1.574 9%）、17.138 7%（RSD=1.433 2%）、1.054 0% （RSD=1.185 7%），1.462 4%（RSD=1.742 3%），說明本法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取同一批號已知含量樣品6份（含秦皮甲素18.834 1%、秦皮苷16.545 0%、秦皮乙素1.033 6%、秦皮素1.435 6%）各5 mg，精密稱定，分別精密加入0.984 0 mg/mL秦皮甲素1.0 mL、0.933 0 mg/mL秦皮苷1.0 mL、0.080 8 mg/mL秦皮乙素0.6 mL、0.152 9 mg/mL秦皮素0.5 mL，精密加入6.90 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，精密吸取8 μL進樣分析，計算4種成分的回收率及其RSD，結(jié)果見表3～表6。秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的平均回收率分別為96.97%、100.80%、99.04%、98.77%，RSD（n=6）分別為1.26%、2.22%、2.47%、1.94%。說明本法準(zhǔn)確性良好。

2.2.10 樣品測定 取秦皮醇提取物、水提取物樣品各3份，約5 mg，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，在上述色譜條件下進行樣品測定，結(jié)果見表7。

3 討論

秦皮提取物中香豆素類成分是其發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，其中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素具有明確的藥理活性，所以，以秦皮提取物中總香豆素含量及4種主要香豆素成分作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，是發(fā)揮其藥效的重要保證。

本研究采用UV測定秦皮提取物總香豆素含量，采用HPLC測定秦皮提取物4種主要香豆素成分的含量，2種方法線性關(guān)系良好，精密度、穩(wěn)定性好，重復(fù)性和加樣回收率符合規(guī)定，可用于秦皮提取物總香豆素和主要香豆素成分的質(zhì)量控制。

本課題組已建立了秦皮藥材中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的含量測定方法，本研究根據(jù)以往工作基礎(chǔ)[6]以甲醇作為提取溶媒；試驗對超聲處理、加熱回流2種提取方法進行了比較，測得秦皮提取物4種成分含量總和的結(jié)果顯示，超聲法略優(yōu)于回流法；對甲醇用量10、20、30 mL提取進行比較試驗，結(jié)果顯示不同甲醇用量測得4種成分含量總和相近，故采用10 mL進行提取；對超聲提取20、30、40 min測得4種成分含量總和進行比較，結(jié)果超聲40 min提取效果最佳。本研究參考前期藥材檢測方法及藥典方法，對甲醇-0.25%醋酸水溶液、甲醇-0.30%醋酸水溶液、乙腈-0.01%磷酸水溶液等流動相系統(tǒng)進行考察，最終確定乙腈-0.01%磷酸水溶液系統(tǒng)，并采用梯度洗脫，縮短了檢測時間，使4個成分在30 min內(nèi)達(dá)到良好分離。

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（收稿日期：2015-02-22）

（修回日期：2015-03-16；編輯：陳靜）