董宇青 張瑞芳

MiR-26b增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞株Hela的殺傷活性研究

董宇青 張瑞芳

目的 觀察microRNA-26b（miR-26b）聯(lián)合順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷效果，并探討其作用機(jī)制。方法 熒光定量PCR方法檢測(cè)人正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614及宮頸癌細(xì)胞系Hela、Si-Ha和C-33a的miR-26b表達(dá)水平。MTT法檢測(cè)順鉑單獨(dú)治療及聯(lián)合miR-26b治療對(duì)宮頸癌細(xì)胞系Hela的殺傷活性。利用生物信息學(xué)及Western blot方法驗(yàn)證miR-26b是否調(diào)節(jié)Hela細(xì)胞Mcl-1表達(dá)。構(gòu)建Mcl-1真核表達(dá)載體，MTT法檢測(cè)Mcl-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染對(duì)miR-26b聯(lián)合順鉑殺傷Hela細(xì)胞療效的影響。結(jié)果 宮頸癌細(xì)胞系miR-26b表達(dá)水平：Hela細(xì)胞為（0.21±0.04），SiHa細(xì)胞為（0.42±0.03），C-33a細(xì)胞為（0.33±0.03），顯著低于正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614的（1.00±0.05）（P＜0.05）。miR-26b聯(lián)合1μmol/L順鉑治療組對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性［細(xì)胞活力抑制率為（52.6± 6.9）%］顯著高于1μmol/L順鉑單治療組［細(xì)胞活力抑制率為（6.7±3.5）%］。miR-26b轉(zhuǎn)染后，Hela細(xì)胞Mcl-1蛋白表達(dá)水平下降。miR-26b聯(lián)合1μmol/L順鉑在Mcl-1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性［細(xì)胞活力抑制率為（19.6±6.7）%］顯著低于未轉(zhuǎn)染Mcl-1表達(dá)載體的miR-26b聯(lián)合1μmol/L順鉑組［細(xì)胞活力抑制率為（55.7±7.6）%］。結(jié)論 MiR-26b通過(guò)靶向于Mcl-1增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞系Hela的殺傷活性。

宮頸癌；miR-26b；Mcl-1；Hela；順鉑

MicroRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，能通過(guò)與靶基因mRNA的3’非編碼區(qū)（3′UTR）配對(duì)結(jié)合下調(diào)靶基因的表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn)microRNA的失調(diào)和腫瘤發(fā)生有關(guān)[1]。miR-26b（microRNA-26b）被報(bào)道與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥產(chǎn)生有關(guān)[2-3]，本研究探討miR-26b是否在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，并研究miR-26b是否能增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷活性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞、SiHa細(xì)胞、C-33a細(xì)胞及人正常宮頸細(xì)胞系CRL-2614細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)ATCC（American Type Culture Collection）。宮頸癌細(xì)胞系和CRL-2614細(xì)胞均予含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入0.1ng/mL人重組表皮生長(zhǎng)因子，0.05mg/mL牛垂體提取物。所有細(xì)胞置于37°C恒溫培養(yǎng)箱，通入5%CO2。

1.2 材 料 順鉑、噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲亞砜（DMSO）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、牛垂體提取物均購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco。細(xì)胞蛋白提取液購(gòu)于江蘇碧云天。兔抗人Mcl-1和兔抗人β-actin購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling。PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Millipore。ECL試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce。MiR-26b模擬物和陰性對(duì)照寡核苷酸（NCO）購(gòu)于上海吉瑪生物。miR-26b模擬物序列為：5'-UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3'；NCO序列為：5'-UGUAAUAAUGGAACUCGGAUU-3'。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、pcDNA3.1、Lipofectamine2000購(gòu)于美國(guó) Invitrogen。SYBR Green試劑購(gòu)于日本TaKaRa。各PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)miR-26b表達(dá) CRL-2614、Hela、SiHa和C-33a細(xì)胞總RNA用Trizol試劑提取。miR-26b的逆轉(zhuǎn)錄采用莖環(huán)RT-qPCR法（逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR）[4]。將U6作為內(nèi)參，miR-26b的相對(duì)表達(dá)由2-△△CT法計(jì)算[5]。miR-26b逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TCAGTTGAGACCTATCC-3′。U6定量PCR上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建 將Mcl-1基因cDNA全長(zhǎng)序列（Gene ID：NM_001197320）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-Mcl-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒[6]。

1.5 順時(shí)轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine2000按照試劑操作說(shuō)明步驟將miR-26b或NCO（50pmol/mL），pcDNA3.1-Mcl（2μg/mL）轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中，培養(yǎng)24h。

1.6 Western blot試驗(yàn) 將50pmol/mL miR-26b用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞并裂解，裂解后的蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE，之后將凝膠取下，將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，并在Mcl-1或β-actin一抗稀釋液中孵育過(guò)夜，之后在帶辣根過(guò)氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2h，ECL試劑顯色曝光。

1.7 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性 將Hela細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上。將50pmol/ mL miR-26b或陰性對(duì)照RNA（NCO）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，孵育24h，然后再加低濃度順鉑（1μmol/L）或高濃度順鉑（5μmol/L）培養(yǎng)48h。之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，570nmol/L波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞活力抑制率計(jì)算公式：抑制率=（OD對(duì)照組-OD治療組）/OD對(duì)照組×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，并用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，P值計(jì)算采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌細(xì)胞系下調(diào)miR-26b表達(dá) 三種宮頸癌細(xì)胞系Hela、SiHa和C-33a細(xì)胞的miR-26b表達(dá)水平均顯著低于正常宮頸上皮細(xì)胞系CRL-2614細(xì)胞（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌細(xì)胞系下調(diào)miR-26b表達(dá)（±s）

表1 宮頸癌細(xì)胞系下調(diào)miR-26b表達(dá)（±s）

注：與CRL-2614細(xì)胞比較，*P＜0.05

CRL-2614 Hela SiHa C-33a 3333 1.00±0.05 0.21±0.04* 0.42±0.03* 0.33±0.03*

2.2 各組Hela細(xì)胞殺傷活性比較 miR-26b聯(lián)合順鉑治療組對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性顯著高于同濃度順鉑單治療組，見(jiàn)表2。提示miR-26b可顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌的治療效果。

表2 各組Hela細(xì)胞活力抑制力比較（±s）

表2 各組Hela細(xì)胞活力抑制力比較（±s）

注：與NCO對(duì)照組比較，*P＜0.05；與miR-26b單治療組比較，△P＜0.05；與1μmol/L順鉑單治療組比較，#P＜0.05；與5μmol/L順鉑單治療組比較，□P＜0.05；NCO：寡核苷酸

NCO對(duì)照組miR-26b單治療組1μmol/L順鉑單治療組5μmol/L順鉑單治療組miR-26b+1μmol/L順鉑治療組miR-26b+5μmol/L順鉑治療組333333 0 50 005 0 50 001515 0 4.5±2.3 6.7±3.5 56.7±8.4* 52.6±6.9*△#85.4±9.9*△□

表3 pcDNA3.1-Mcl廢除miR-26b對(duì)順鉑的協(xié)同作用（±s）

表3 pcDNA3.1-Mcl廢除miR-26b對(duì)順鉑的協(xié)同作用（±s）

注：與NCO對(duì)照組比較，*P＜0.05;與miR-26b+1μmol/L順鉑治療組比較，△P＜0.05；與miR-26b+5μmol/L順鉑治療組比較，#P＜0.05；NCO：寡核苷酸

組別NCO對(duì)照組miR-26b+1μmol/L順鉑治療組miR-26b+5μmol/L順鉑治療組pcDNA3.1-Mcl-1+miR-26b+1μmol/L順鉑治療組pcDNA3.1-Mcl-1+miR-26b+5μmol/L順鉑治療組孔數(shù)pcDNA3.1-Mcl-1濃度（μg/mL）33333 00022 miR-26b濃度（pmol/mL）0 50 50 50 50順鉑濃度（μmol/L）01515細(xì)胞活力抑制率（%）0 55.7±7.6* 84.4±10.1* 19.6±6.7*△33.6±8.5*#

2.3 miR-26b增強(qiáng)順鉑對(duì)Hela細(xì)胞殺傷活性依賴(lài)于Mcl-1水平下調(diào) 生物信息學(xué)（http://www.targetscan.org/）結(jié)果表明，Mcl-1基因可能是miR-26b的靶點(diǎn)（圖1），進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-26b轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后Mcl-1的表達(dá)量顯著低于未轉(zhuǎn)染miR-26b組（圖2）。此外，MTT試驗(yàn)結(jié)果則發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1-Mcl-1的共轉(zhuǎn)染顯著抑制了miR-26b聯(lián)合順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性，見(jiàn)表3。提示miR-26b增強(qiáng)順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷活性可能通過(guò)下調(diào)Mcl-1的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。

圖1 Mcl-1基因是miR-26b的潛在靶點(diǎn)

圖2 轉(zhuǎn)染miR-26b下調(diào)Hela細(xì)胞Mcl-1表達(dá)水平

3 討論

宮頸癌是全球發(fā)病率第二位的婦科腫瘤，每年有超過(guò)50萬(wàn)患者被診斷為宮頸癌，化療是治療宮頸癌的主要手段[7]。順鉑是目前最主要的抗腫瘤藥物之一，能有效治療結(jié)腸癌、卵巢癌、肺癌和宮頸癌[8-9]。長(zhǎng)期化療往往導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生，因此，如何選用最佳的輔助藥物以取得最好的療效，并降低順鉑的耐藥性是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)[10]。

在本研究中，相比于正常宮頸上皮細(xì)胞系，宮頸癌腫瘤細(xì)胞系的miR-26b表達(dá)水平顯著下調(diào)，表明miR-26b在宮頸癌細(xì)胞中可能發(fā)揮腫瘤抑制作用。有文獻(xiàn)報(bào)道表明miR-26b在其他各種腫瘤類(lèi)型中也同樣發(fā)揮抗腫瘤作用，如miR-26b能通過(guò)下調(diào)CDK8的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[11]，而在肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-26b則能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移凋亡[12]，這些報(bào)道和本研究均提示miR-26b可能是一個(gè)抑癌基因。然而，本研究發(fā)現(xiàn)miR-26b單獨(dú)治療宮頸癌的效果并不十分顯著，卻能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用，通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b的這種化療協(xié)同作用可能和Mcl-1蛋白的下調(diào)有關(guān)。

Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中一個(gè)重要的抗凋亡蛋白成員，它的高表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的不良預(yù)后及多藥耐藥密切相關(guān)[13]。有報(bào)道[14]表明，腫瘤細(xì)胞中Mcl-1的高表達(dá)會(huì)顯著增強(qiáng)包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤的存活能力和對(duì)細(xì)胞毒性化療藥物的抵抗力。本研究結(jié)果顯示，在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒使細(xì)胞中Mcl-1發(fā)生過(guò)表達(dá)后，miR-26b對(duì)順鉑的協(xié)同抗宮頸癌作用受到顯著抑制，證實(shí)miR-26b增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤的機(jī)制是靶向于Mcl-1蛋白。綜上所述，miR-26b/Mcl-1途徑與順鉑的抗宮頸癌活性密切相關(guān)，它可能成為腫瘤化療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

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（收稿：2015-03-26 修回：2015-04-13）

M iR-26b Enhances the Cytotoxicity of Cisplatin by Targeting M cl-1 in Cervical Cancer Cell Line Hela

Dong Yuqing,Zhang Ruifang. Clinical Laboratory,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou (310007),China

Objective To investigate the effect of microRNA-26b（miR-26b）on cisplatin therapy in treatment of cervical cancer in vitro,and to explore the underlying mechanism.M ethods The miR-26b level in normal cervical cell line CRL-2614 and cervical cancer cell lines Hela,SiHa and C-33a were detected by using RT-qPCR. MTT assay was performed to measure the growth inhibition capacity of miR-26b plus cisplatin in Hela cells. Bioinformatics and western blot were performed to determine whether the expression of Mcl-1 in Hela cells was regulated by miR-26b.A Mcl-1 expression vector was constructed to detect the role of Mcl-1 vector toward miR-26b plus cisplatin-inducing cytotoxicity in Hela cells by MTT assay.Results A down-regulation of miR-26b was found in cervical cancer cell lines Hela（0.21±0.04）,SiHa（0.42±0.03）,and C-33a（0.33±0.03）compared with that in normal cervical cell line CRL-2614（1.00±0.05）.The miR-26b plus 1mol/L cisplatin group showed a higher growth inhibition（52.6%±6.9%）than 1μmol/L cisplation group（6.7%±3.5%）in Hela cells.The expression of Mcl-1 at protein level was down-regulated after miR-26b transfection.The growth inhibition of Hela cells treated with miR-26b plus cisplatin was significantly decreased after transfection of Mcl-1 expression vector.Conclusion miR-26b sensitizes cisplatin-induced cytotoxicity by targeting Mcl-1 in cervical cancer.

cervical cancer;miR-26b;Mcl-1;Hela;cisplatin

杭州市中醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州 310007）

董宇青，Tel：15088687659；E-mail：hzdongyuqing@163.com