·綜述·

中藥多糖對(duì)生精細(xì)胞凋亡影響的研究進(jìn)展

Research progress of flavonoids inducing tumor cell apoptosis in vitro and its mechanism

,馬帥(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林132013)

摘要：生精細(xì)胞過(guò)度凋亡是導(dǎo)致男性不育的主要原因。中藥多糖在治療男性不育方面具有較好的作用。本文就中藥多糖對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響作一綜述，以期為中藥多糖在臨床治療男性不育提供更多的理論依據(jù)，并促進(jìn)中藥多糖的臨床開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：中藥多糖；男性不育；生精細(xì)胞；凋亡

文章編號(hào)：1673-2995(2015)06-0476-04

中圖分類號(hào)：R285

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目資助課題(2014544)；2014年吉林省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助.

作者簡(jiǎn)介：趙東海(1975-),男(漢族)，副教授，博士.

收稿日期：(2015-07-04)

生精細(xì)胞凋亡是指生精細(xì)胞的程序性死亡，在精子發(fā)生過(guò)程中，各級(jí)生精細(xì)胞都存在此種現(xiàn)象，且受到多種因素的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)。在正常生理?xiàng)l件下，這種凋亡能幫助機(jī)體清除異常精子并有利于控制精子數(shù)量，但過(guò)度則可導(dǎo)致少精或弱精癥，是男性不育的主要原因。在當(dāng)前，男性不育癥發(fā)病率不斷上升，它將與癌癥、心血管疾病成為21世紀(jì)對(duì)人類影響最大的疾病，因此關(guān)于有效抑制生精細(xì)胞凋亡的研究顯得十分重要。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在中藥多糖治療男性不育方面做了大量研究，發(fā)現(xiàn)其具有很好的治療效果。現(xiàn)根據(jù)已有文獻(xiàn)就其通過(guò)不同途徑抑制生精細(xì)胞凋亡做一總結(jié)。

1　調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑

1.1　線粒體途徑

許多研究結(jié)果都表明，線粒體在調(diào)控生精細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著“主開(kāi)關(guān)”的作用，在細(xì)胞內(nèi)外的各種凋亡信號(hào)刺激下，它的膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C),釋放到胞漿的Cyt C在dATP存在下與Apaf-1結(jié)合，形成多聚體，并促使caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，進(jìn)而啟動(dòng)下游天蛋白酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[1]。譚秋慧等[2]以雄性SD大鼠為研究對(duì)象，觀察熱應(yīng)激后多糖對(duì)生精細(xì)胞的影響。通過(guò)TUNEL法檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡，免疫組化法檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)，ELISA法檢測(cè)睪丸組織胞質(zhì)Cyt C濃度，發(fā)現(xiàn)與熱應(yīng)激組比較，各多糖組的凋亡指數(shù)均明顯降低(P<0.05)，免疫組化顯示生精細(xì)胞Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)明顯減少(P<0.05)，胞質(zhì)Cyt C濃度顯著降低(P<0.05)。由以上結(jié)果推測(cè)，多糖具有減少生精細(xì)胞發(fā)生凋亡，維持生精上皮的功能的作用，而這種作用與抑制線粒體途徑有密切關(guān)系。劉軍等[3]研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖的干預(yù)具有減少大鼠睪丸細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。提前應(yīng)用海帶多糖灌胃后，可降低由局部慢性電離輻射導(dǎo)致的大鼠睪丸Caspase-3的表達(dá)，而且不同程度的減輕對(duì)睪丸組織的損傷，表現(xiàn)為彗星拖尾率和尾長(zhǎng)均減少，證實(shí)海帶多糖具有修復(fù)睪丸損傷的作用。

1.2　死亡受體途徑

死亡受體位于細(xì)胞表面，它具有與死亡配體結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，引發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，而且死亡受體與配體的結(jié)合具有專一性的特點(diǎn)。在生精細(xì)胞凋亡中常由FasL/Fas系統(tǒng)介導(dǎo)，普遍認(rèn)為，F(xiàn)as表達(dá)于生精細(xì)胞,而FasL表達(dá)于支持細(xì)胞，當(dāng)兩者特異性結(jié)合時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。并且有研究表明其在人類睪丸中的表達(dá)受激素調(diào)控[4-5]。

張迅等[6]報(bào)道，用解支原體經(jīng)膀注射后制備大鼠生殖損傷模型，然后連續(xù)45 d給模型灌胃知柏地黃湯，結(jié)果顯示，與正常組、知柏地黃湯組及美滿霉素治療組相比，模型組解支原體陽(yáng)性率、生殖細(xì)胞凋亡率均明顯增高，而且Fas和FasL的表達(dá)水平也呈增高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在正常組、知柏地黃湯組及美滿霉素治療組三組中，以上各項(xiàng)指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示，知柏地黃湯具有減少解支原體引起的生殖細(xì)胞凋亡的作用，其抗生殖細(xì)胞凋亡是通過(guò)下調(diào)Fas和FasL的表達(dá)而發(fā)揮作用的。

2　調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)

2.1　Bcl-2家族

Bcl-2蛋白家族是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因研究得最多的一類蛋白質(zhì)，包含抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì)，分別以Bcl-2和Bax為代表。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控體系中，Bcl-2蛋白及其家族成員相互作用，并共同構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，抑制或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡生物學(xué)活動(dòng)的發(fā)生。在這其中，Bcl-2蛋白家族與線粒體之間的作用、Bcl-2蛋白家族中各蛋白的相互作用以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和氧自由的含量均與細(xì)胞凋亡的發(fā)生有密切的關(guān)系[7]。而生精細(xì)胞中，Bcl-2和Bax的比值是生精細(xì)胞凋亡的決定性因素。

李曉彩等[10]利用雙酚A制備了雄性小鼠生精功能障礙損傷模型，然后觀察給予不同劑量LBP后，LBP對(duì)小鼠生精功能障礙的治療情況。研究結(jié)果顯示，LBP作用后可影響生精損傷小鼠Caspase-3蛋白的表達(dá)，使Caspase-3蛋白表達(dá)量降低。而且，初級(jí)精母細(xì)胞及各級(jí)精母細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)含量有明顯增加的趨勢(shì)。在應(yīng)用LBP后，陽(yáng)性表達(dá)Bax的生精細(xì)胞數(shù)量也明顯減少，Bcl-2蛋白與Bax蛋白比值變大，而且這種變化呈現(xiàn)劑量依賴性，作用效果最好的LBP劑量為200 mg/kg，證實(shí)LBP具有減少由雙酚A引起的生精細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用，作用機(jī)制與改變了Bcl-2、Bax等Bcl-2蛋白家族蛋白表達(dá)并引起下游Caspase-3的表達(dá)變化、降低生精細(xì)胞凋亡有關(guān)。

李德遠(yuǎn)等[11]用60Co-γ射線照射雄性小鼠后制備生精障礙模型，發(fā)現(xiàn)60Co-γ射線可導(dǎo)致雄性小鼠出現(xiàn)睪丸細(xì)胞微核率、精子畸形率及睪丸精母細(xì)胞染色體畸形率等明顯升高的情況，證實(shí)60Co-γ射線照射可引起生精損傷。而LBP混合至鼠糧中飼養(yǎng)6周后，發(fā)現(xiàn)LBP組微核率、精子畸形率及睪丸精母細(xì)胞染色體畸形率等顯著降低，生精細(xì)胞損傷表現(xiàn)得以明顯的改善。同時(shí)，LBP組小鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)升高而caspase-3 mRNA表達(dá)降低，提示LBP可以通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)抑制生精細(xì)胞凋亡，緩解生殖系統(tǒng)損傷。

2.2　 p53基因

p53基因是一種重要的抑癌基因,野生型p53能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞正常生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。而一旦p53基因發(fā)生突變，則可誘發(fā)多種細(xì)胞發(fā)生惡性突變。p53在睪丸中主要表達(dá)于生精細(xì)胞，其編碼的蛋白可從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體，誘導(dǎo)其下游與氧化還原有關(guān)的基因表達(dá)后，導(dǎo)致局部活性氧含量增多，進(jìn)而影響線粒體的結(jié)構(gòu)。這種變化引發(fā)的結(jié)果是使凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體中釋放出來(lái)，在細(xì)胞漿中凋亡誘導(dǎo)因此可激活Caspase,從而誘導(dǎo)自發(fā)性和損傷性生精細(xì)胞凋亡。補(bǔ)腎方劑何首烏飲(又名天年飲)是由何首烏、肉蓯蓉、懷牛膝、丹參、茯苓組成的中藥復(fù)方多糖，具有補(bǔ)肝腎、益精血、延年益壽之功效。杜金凱等[12]觀察天年飲對(duì)睪丸生精細(xì)胞凋亡及相關(guān)因素的影響，發(fā)現(xiàn)衰老大鼠血清睪酮含量明顯降低(模型組與正常組比較,P<0.05),衰老大鼠睪丸p53陽(yáng)性細(xì)胞率及凋亡指數(shù)明顯高于正常大鼠(P<0.01)，天年飲用藥組大鼠血清睪酮含量較衰老大鼠明顯升高(P<0.05),天年飲用藥組大鼠睪丸p53陽(yáng)性細(xì)胞率及凋亡指數(shù)較衰老大鼠明顯降低(P<0.05,P<0.01)，提示天年飲可以通過(guò)調(diào)節(jié)p53表達(dá)抑制凋亡，改善大鼠睪丸生殖功能。

3　調(diào)節(jié)激素平衡

曲精小管中維持較高水平的睪酮是精子發(fā)生的最重要條件。有大量研究結(jié)果證實(shí)，生精細(xì)胞發(fā)生凋亡主要原因與睪丸組織中睪酮含量的明顯減少密切相關(guān)[13]。機(jī)體內(nèi)睪酮的產(chǎn)生受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，以負(fù)反饋的形式調(diào)節(jié)體內(nèi)睪酮含量。促性腺激素釋放激素(GnRH)由下丘腦分泌產(chǎn)生，分泌入血后作用于腺垂體，刺激腺垂體分泌產(chǎn)生分泌FSH和LH。生精小管上皮中的支持細(xì)胞表面有FSH的受體，受體與FSH結(jié)合后促進(jìn)支持細(xì)胞合成、分泌并產(chǎn)生干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)，SCF則可促進(jìn)精子發(fā)生。LH則與生精上皮中的睪丸間質(zhì)細(xì)胞受體結(jié)合后，使得睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生雄激素[14]。

羅瓊等[15]的研究結(jié)果顯示，LBP具有改善雄性大鼠生殖功能的作用，而且可以提高血清中睪酮的水平，但與陽(yáng)性對(duì)照組及正常對(duì)照組相比，其改善和提高血清睪酮的水平遠(yuǎn)低于以上兩組。研究認(rèn)為，LBP并不是雄激素類似物,不具有雄激素樣作用，LBP發(fā)揮生精作用的主要機(jī)制是通過(guò)對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸的反饋調(diào)節(jié)，維持體內(nèi)各分泌刺激素或激素的水平穩(wěn)定，如通過(guò)降低氧化應(yīng)激損傷或改善微環(huán)境等來(lái)治療由外界因素導(dǎo)致的生精功能紊亂，從而改善大鼠生精功能的障礙。

張艷等[16]研究顯示，五味子多糖能夠有效治療由環(huán)磷胺(CTX)導(dǎo)致的大鼠生精功能的障礙，五味子多糖各劑量組精子密度、精子活率升高，精子畸形率降低，血清FSH和LH水平降低，睪丸組織勻漿中T含量升高，且劑量組呈劑量依賴性，組織學(xué)觀察顯示，五味子多糖各劑量組大鼠睪丸組織病理性損害均得到改善，提示五味子多糖可能通過(guò)促進(jìn)睪丸組織再生，使激素分泌正常，恢復(fù)下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)控作用改善生精功能。

4　清除氧自由基

在正常情況下，睪丸內(nèi)氧自由基(ROS)生成與清除處在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，有重要生理意義。然而，過(guò)多的ROS將啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),引起睪丸組織氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡,導(dǎo)致氧化應(yīng)激,從而引起睪丸組織的損傷和生精細(xì)胞凋亡，且由于生精細(xì)胞膜含有豐富的多不飽和脂肪，使生精細(xì)胞比體細(xì)胞更易受到ROS損傷。同時(shí)，有研究證實(shí)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)往往伴隨睪酮分泌降低現(xiàn)象，從而兩者共同引起生精細(xì)胞凋亡[17-18]。己烯雌酚(DES)是一種人工合成雌激素，對(duì)雄性生殖系統(tǒng)有毒害作用，相關(guān)研究顯示，DES組小鼠睪丸重量與睪丸臟器系數(shù)顯著降低，小鼠睪丸組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷甘過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力顯著下降而丙二醛(MDA)含量上升[19]。黃芪多糖(APS)、LBP分別是黃芪和的重要組成成分，有研究證實(shí)這兩種重要多糖對(duì)DES誘導(dǎo)的小鼠生殖損傷有顯著緩解作用。其力根等[20]觀察到經(jīng)APS灌胃后的DES小鼠睪丸組織中SOD、GSH-Px活力均高于DES組，差異顯著，其中100 mg/kg組最高，MDA含量均低于DES組，差異顯著，其中60 mg/kg組最低，血清中T、LH、GnRH的含量均顯著增加。張彩利等[21]給DES小鼠服用LBP觀察到小鼠血清SOD、GSH-Px升高，MDA下降，激素水平也有了明顯回升，以50 mg/kg作用最為顯著。60Co-γ射線輻射期間給予LBP，LBP各劑量組均可增加生殖系統(tǒng)損傷后大鼠睪丸組織SOD活性，降低MDA含量，其中以10 mg/kg劑量效果最好。這些都提示APS、LBP通過(guò)增加小鼠體內(nèi)SOD水平，提高清除超氧陰離子自由基的能力，使機(jī)體總的清除ROS的能力上升，減輕ROS對(duì)生精細(xì)胞的損傷[22]。另外，已有許多文獻(xiàn)報(bào)道都表明了中藥多糖如山茱萸多糖，烏賊墨多糖，海帶多糖，靈芝多糖，人參多糖可能通過(guò)抗氧化作用緩解各種因素,如高溫輻射等導(dǎo)致的生精細(xì)胞損傷。

5　小　結(jié)

中藥多糖作為中藥主要有效成分之一，來(lái)源廣，毒副作用小，且又具有確切的調(diào)控生殖細(xì)胞凋亡的作用，為臨床研發(fā)治療男性不育藥提供了方向。但是由于中藥多糖本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性以及受實(shí)驗(yàn)技術(shù)水平的限制，關(guān)于其在治療男性不育癥調(diào)控生精細(xì)胞凋亡準(zhǔn)確機(jī)制上尚有許多未得以闡明，根據(jù)前面所述，我們也可以看到它對(duì)凋亡作用是多環(huán)節(jié)、多靶位、多途徑的。因此，筆者認(rèn)為進(jìn)一步加強(qiáng)中藥多糖對(duì)生精細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)研究，加大對(duì)中藥多糖構(gòu)效和組效的研究，不僅對(duì)深入了解中藥多糖抗凋亡作用機(jī)制，治療不育有重要的理論意義，而且可進(jìn)一步指導(dǎo)中藥多糖類新藥的研制和開(kāi)發(fā)。

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