·論著·

五味子乙素對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡及Hsp-70基因表達(dá)的影響

李正祎1，于

2，張雪3，代龍光3，蔣明鳳3(

吉林醫(yī)藥學(xué)院:1.檢驗(yàn)學(xué)院，2.2011級(jí)藥物制劑本科班，3.2012級(jí)臨床輸血本科班,吉林 吉林132013)

摘要：目的探討五味子乙素(Sch B)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用，并研究其可能機(jī)制。方法10、25、50、75、100 μmol/L Sch B作用于HepG2細(xì)胞，通過MTT法篩選低毒性的Sch B濃度，梯度濃度Sch B作用HepG2細(xì)胞48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性；Western blot法檢測(cè)Sch B作用HepG2細(xì)胞48 h后不同濃度組熱休克蛋白-70(Hsp-70)的表達(dá)情況；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期改變。結(jié)果Sch B能夠抑制HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈濃度依賴性；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示10、25 μmol/L Sch B組細(xì)胞在Sub-G1期明顯高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論Sch B促凋亡機(jī)制可能與下調(diào)Hsp-70蛋白的表達(dá)有關(guān)；如做免疫調(diào)節(jié)劑與其他抗癌藥物聯(lián)合使用最佳給藥濃度為10 μmol/L。

關(guān)鍵詞：HepG2細(xì)胞；五味子乙素；熱休克蛋白-70

文章編號(hào)：1673-2995(2015)06-0401-04

中圖分類號(hào)：R73-3

作者簡(jiǎn)介：李正祎(1975-)，男(漢族)，副教授，博士.

收稿日期：(2015-07-04)

Effect of schisandrin B on cell apoptosis and Hsp-70 gene expression in HepG2 Cells

LI Zhengyi1,YU Ting2,ZHANG Xue3,DAI Longguang3,JIANG Mingfeng3(1.Academy of Laboratory,2.2011 Pharmaceutical Class of Department of Pharmacy,3.2012 Transfusion Class of Department of Medical Laboratory,Jilin Medical University,Jilin City，Jilin Province,132013,China)

Abstract:Objective To explore the inhibition effect of different concentration schisandrin B(Sch B) on HepG2 and its mechanism. MethodsCultivating HepG2 cells with 10,25,50,75,100 μmol/L Sch B respectively,the MTT method was employed to screened the low toxicity concentration of Sch B.After cultivating with the above gradient concentration schisandrin B,the stereochimical structure of HepG2 cells were observed by invert microscope and its activity was detected by MTT method and western blot was utilized to observe the expression of Hsp-70.The apoptosis condition and cell cycle were detected by flow cytometory. ResultsSch B had anti-proliferation effect on HepG2 cells growth in dose-dependent manner.The results of flow cytometry showed that the percentage of HepG2 in sub-G1 phase in 10 μmol/L and 25 μmol/L Sch B group were significantly increased than that in negative control groups (P<0.05). ConclusionThe mechanism of HepG2 cell apoptosis induced by Sch B is probably associated with the down-regulation of Hsp-70 protein expression.The best concentration was 10 μmol/L when the Sch B,as the immunomodulator,is combined with other anticancer drug.

Key words:human hepatocellular carcinoma HepG2 cell;schisandrin B;heat shock proteins-70

五味子為木蘭科植物五味子的成熟干燥的果實(shí)，被稱為最著名的滋補(bǔ)性中藥，由于其果實(shí)甘、酸、辛、苦、咸五味俱全,故名五味子[1]。五味子乙素(schisandrin,Sch B)通過對(duì)大鼠口服給藥后觀察，其體內(nèi)的主要代謝途徑首先是經(jīng)肝臟代謝，其次是經(jīng)腎

臟代謝，并且同時(shí)存在肝腸循環(huán)代謝[2]。Sch B作為傳統(tǒng)中藥的一種活性成分，具有多方面作用。Sch B可對(duì)阿霉素引起的腫瘤細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用[3]；Sch B可促進(jìn)多柔比星誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞(SMMC-7721)凋亡[4]；Sch B聯(lián)合順鉑能更好的抑制H22移植瘤的增值，并促進(jìn)Caspase3、8、9表達(dá)而促進(jìn)其凋亡[5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過Sch B作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡水平、熱休克蛋白-70(Hsp-70)基因表達(dá)水平等相關(guān)指標(biāo)探索Sch B抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1　材料與方法

1.1　材　料

HepG2細(xì)胞(人肝癌細(xì)胞)來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室；Sch B購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度為98%；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)于Amresco公司；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；Hsp-70購(gòu)于中杉金橋公司；二甲基亞(DMSO)購(gòu)于Solarbio公司；酶標(biāo)儀型號(hào)為PI-3502G(北京普天新橋技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀型號(hào)為Epics XL(美國(guó)貝克曼公司)。

1.2　HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

37 ℃、5%條件下，用含10%FCS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化傳代。

1.3　MTT法檢測(cè)不同濃度Sch B對(duì)細(xì)胞的毒性作用

取對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞以2×104/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，分空白對(duì)照組、Sch B 10、25、50、75、100 μmol/L組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；培養(yǎng)24 h后用MTT法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算Sch B對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率IR，公式：IR=(1-藥物組A值/對(duì)照組A值)×100%，選擇抑制率IR<10%的低毒性最佳Sch B濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4　形態(tài)學(xué)觀察

將對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞以1×105/孔接種于六孔板，在37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,換成無(wú)血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后給藥，實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組，10、25、50、100 μmol/L濃度Sch B組，給藥后48 h，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5　FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞，以1×105/孔接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h后，換成無(wú)血清的1640培養(yǎng)液，4 h后進(jìn)行給藥，實(shí)驗(yàn)分為0、10、25 μmol/L Sch B組；培養(yǎng)48 h后收取細(xì)胞，將每孔收取的細(xì)胞用5 mL 80%的甲醇(-20 ℃下)固定12 h，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并分析圖譜。

1.6　Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)

取對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞，以1×105/孔接種于六孔板，培養(yǎng)24 h后，換成無(wú)血清的1640培養(yǎng)液，4 h后給藥，分組同上，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后根據(jù)細(xì)胞濃度加細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白的提取，然后進(jìn)行超聲處理，最后用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。用60 μg/孔蛋白量上樣，10% SDS-PAGE分離，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h。加入一抗(1∶500鼠抗人Hsp-70、β-actin)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗(5 min×3次)后，加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的1∶3 000羊抗鼠IgG) 室溫孵育2 h，TBST充分漂洗(5 min×3次)，化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)2 min，X光片暗室曝光，常規(guī)顯影、定影。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)　果

2.1　MTT法檢測(cè)不同濃度Sch B對(duì)細(xì)胞的毒性作用

Sch B按濃度為10、25、50、75、100 μmol/L分為5組，用MTT法所檢測(cè)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率IR結(jié)果如圖1所示，Sch B對(duì)細(xì)胞的抑制作用隨著濃度增高抑制作用增強(qiáng)，并呈濃度依賴性，雖然10、25 μmol/L Sch B對(duì)HepG2細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，分別為6.8%和10.5%，但50、75、100 μmol/L Sch B對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用明顯增大。因此選用10、25 μmol/L Sch B濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖 1　不同濃度Sch B對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率測(cè)定

2.2　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見對(duì)照組的未給藥細(xì)胞較密集，且細(xì)胞間的連接較為緊湊，透光度較好;但在給藥濃度為10、25 μmol/L時(shí)，細(xì)胞間有明顯的空隙，細(xì)胞呈橢圓形，但細(xì)胞數(shù)目并未有明顯的改變;在濃度為50 μmol/L時(shí)，細(xì)胞形態(tài)呈細(xì)長(zhǎng)型，連接較疏松，細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖2)。

A.Control組；B.10 μmol/L Sch B組；C.25 μmol/L Sch B組；D.50 μmol/L Sch B組

圖2不同濃度Sch B作用HepG2細(xì)胞形態(tài)變化

2.3　Sch B對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果如圖3所示,10、25 μmol/L Sch B處理48 h后,HepG2細(xì)胞在流式細(xì)胞儀的DNA含量直方圖中出現(xiàn)Sub-G1峰,即凋亡細(xì)胞；10 μmol/L Sch B組HepG2細(xì)胞Sub-G1期達(dá)12.95%，25μmol/L Sch B組HepG2細(xì)胞Sub-G1期23.98%，均顯著高于陰性對(duì)照組(0 μmol/L Sch B組)的Sub-G1期1.95%(P<0.05)。

1.Control組；2.10 μmol/L Sch B組；3.25 μmol/L Sch B組

圖3HepG2細(xì)胞經(jīng)Sch B干預(yù)后細(xì)胞周期的變化

2.4　Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示(如圖4)HepG2細(xì)胞株上Hsp-70的含量測(cè)定結(jié)果呈梯度，隨著Sch B濃度的升高Hsp-70蛋白表達(dá)量逐漸減少，表明Sch B能抑制HepG2細(xì)胞Hsp-70蛋白表達(dá)。

3　討　論

肝癌是威脅人類生命的常見疾病，發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率更高，且治療非常困難。Sch B藥理成分是五味子成熟干燥果實(shí)經(jīng)脫脂后提取的木質(zhì)素類藥理活性物質(zhì)，具有多方面作用。五味子在臨床上可用于肝

1.Control組；2.10 μmol/L Sch B組；3.25 μmol/L Sch B組

圖4Sch B對(duì)HepG2細(xì)胞Hsp-70蛋白表達(dá)的影響

癌、胃癌等的治療，進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制與五味子能抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[6]。本研究利用HepG2細(xì)胞體系，使用純化的Sch B作用于細(xì)胞，并從藥效學(xué)角度觀察其對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，MTT及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Sch B能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中DNA含量的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用了Sch B后，處于S期(DNA合成期)細(xì)胞的比例顯著減少，凋亡峰出現(xiàn)在了G1期(DNA合成前期)之前，這提示Sch B可能將肝癌細(xì)胞周期阻滯在Sub-G1期，抑制了DNA的合成，從而達(dá)到抑制或延緩肝癌進(jìn)程的作用。在流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果的提示下，我們關(guān)注了Sch B誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

Hsp是一種進(jìn)化上非常保守的蛋白質(zhì)家族，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，能夠防止未折疊的蛋白質(zhì)變性和促進(jìn)聚集的蛋白質(zhì)溶解復(fù)性，同時(shí)促進(jìn)新生多膚鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)取sp-70在腫瘤組織中大量表達(dá)，為腫瘤生長(zhǎng)所必需。Hsp通過與癌基因的表達(dá)產(chǎn)物或者腫瘤相關(guān)蛋白相互結(jié)合而發(fā)揮作用,介導(dǎo)癌蛋白構(gòu)象成熟及轉(zhuǎn)運(yùn),維持癌蛋白的結(jié)構(gòu)與功能完整，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。早在1995年，Ralhan等采用ELISA法和免疫組織化學(xué)方法第一次證實(shí)了Hsp-70的表達(dá)量與腫瘤的惡性程度成正比[7]。在李華民等[8]報(bào)道中HCC及癌旁肝組織中均有Hsp-70的表達(dá)。尹燕明等[9]報(bào)道在肝癌中Hsp-70陽(yáng)性率為71.0%，顯示在肝癌中Hsp-70高度表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)Sch B能降低HepG2細(xì)胞內(nèi)Hsp-70表達(dá)，降低了Hsp-70對(duì)大量癌基因產(chǎn)物的保護(hù)，不能有效的維持癌蛋白的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)，癌蛋白無(wú)法發(fā)揮正常效應(yīng)，抑制了癌細(xì)胞的活性。同時(shí)如將Sch B今后作為免疫調(diào)節(jié)劑與其他抗肝癌藥物聯(lián)合使用其最佳給藥濃度約為10 μmol/L。

總之Sch B可以對(duì)HepG2細(xì)胞起到增殖抑制作用，其抑瘤活性的具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

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