李智勇，羅 漢，張海英

（1.海口市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南 ?？?570208；2.海南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，海南 海口 571101）

·論 著·

原兒茶酸對Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)AD海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

李智勇1，羅 漢1，張海英2

（1.?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)外科，海南 海口 570208；2.海南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，海南 海口 571101）

目的 應(yīng)用Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)SD胎鼠海馬神經(jīng)元制備細(xì)胞損傷模型，觀察海南益智仁提取物-原兒茶酸(PCA)對模型細(xì)胞的保護(hù)作用。方法采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測ERK蛋白，觀察原兒茶酸對模型細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果Aβ1-42寡聚體干預(yù)SD胎鼠海馬神經(jīng)元后,神經(jīng)元生存率下降，神經(jīng)元凋亡率升高，ERK蛋白表達(dá)下調(diào)。添加原兒茶酸后，模型細(xì)胞存活率改善明顯、凋亡率顯著性降低，且呈現(xiàn)濃度依賴性，并且ERK蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論原兒茶酸可拮抗Aβ1-42寡聚體所誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

阿爾茨海默?。籄β1-42寡聚體；原兒茶酸；ERK信號(hào)通路

阿爾茨海默病(AD)的防治具有積極的社會(huì)意義，中醫(yī)藥在AD防治中具有獨(dú)到的地位和廣闊的前景。研究發(fā)現(xiàn)，益智仁提取物-原兒茶酸(Protocatechuic acid，PCA)為天然酚酸類化合物，是益智仁的有效活性成分，具有良好的抗氧化作用[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PCA對的缺血、缺氧神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用[2]。本實(shí)驗(yàn)以Aβ寡聚體誘導(dǎo)AD神經(jīng)元損傷模型，觀察原兒茶酸對AD海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，探討可能的作用機(jī)制，找到AD防治的新途徑和新策略，為進(jìn)一步開發(fā)南藥益智仁新的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 益智仁提取物-原兒茶酸由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離、純化，經(jīng)HPLC檢測，純度不低于98%，兔抗鼠ERK多克隆抗體購自美國Bioworld公司，Aβ1-42購自sigma公司，JC-1 Kit購自Molecular Probe公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞模型的制備及分組 Aβ1-42溶于預(yù)冷的六氟異丙醇中，室溫孵育1 h，使之單體化，隨后蒸發(fā)六氟異丙醇，殘留的肽置于-80°C冰箱，隨后溶于無水的二甲基亞砜中，濃度為5 mmol/L，與F12混勻，濃度為100 μmol/L，置4℃～8℃老化24 h，14 000×g離心10 min，可溶的Aβ寡聚體浮于上層，吸取上層液體，稀釋后用以實(shí)驗(yàn)。1只SD大鼠孕(18±2)d，取胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)14 d后，添加Aβ1-42寡聚體10 μmol/L干預(yù)24 h造模。實(shí)驗(yàn)分為五組：空白組(CTL)，空白組加入含10%胎牛血清的DMEM維持液；Aβ1-42模型組(Aβ1-42)；PCA組(3亞組濃度分別為：Aβ1-4210 μmol/L+PCA 0.1 μmol/L(PCA1組)、Aβ1-4210 μmol/L+PCA 1.0 μmol/L (PCA 2組)、Aβ1-4210 μmol/L+PCA 10 μmol/L(PCA 3組)，先給予PCA 0.5后，再添加Aβ1-42oligomer繼續(xù)培養(yǎng)24 h，檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 PCA對細(xì)胞模型活力的影響 采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)實(shí)驗(yàn)，海馬神經(jīng)元以5×105/ml植入96孔板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組分別加入干預(yù)因素，置CO2孵箱8 h、12 h、24 h后，各孔加入10 μl MTT，培養(yǎng)4 h后，去除培養(yǎng)液，添加200 μl二甲基亞楓，顆粒溶解后使用酶標(biāo)儀，在490 nm的吸光值下，檢測各組的吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分析 實(shí)驗(yàn)各組干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩次，重新懸浮細(xì)胞至1×106/L，取100 μl細(xì)胞液，添加5 μl異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Annexin V和10 μl碘化丙錠混勻。置室溫，避光靜置15 min，各管加入400 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞分析。激發(fā)波長為488 nm，計(jì)數(shù)104個(gè)細(xì)胞。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)Cell Qust軟件收集處理。

1.2.4 Western blot檢測 實(shí)驗(yàn)各組干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗3次，100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)加200μl細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解20 min，15 000 r，4℃離心10 min，取上清液，蛋白定量。以10%SDS電泳分離，半干電轉(zhuǎn)至NC膜，室溫封閉2 h后，加入一抗ERK多克隆抗體，1:500稀釋；4℃過夜，抗羊IgG二抗(1:1 000稀釋)反應(yīng)2 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，GAPDH為內(nèi)參照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，參數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCA對實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞活力的影響 采用MTT檢測PCA對實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)PCA對Aβ1-42模型組細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。Aβ1-42模型組與PCA組相比較，A值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，細(xì)胞活力隨PCA濃度的升高有所改善，呈一定的濃度依賴關(guān)系(量效關(guān)系)，見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組對模型細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6次)

表1 各實(shí)驗(yàn)組對模型細(xì)胞存活率的影響(±s，n=6次)

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別 吸光值(A490) 8 h 12 h 24 h Aβ1-42模型組PCA1組PCA2組PCA3組F值P值0.532±0.013 0.647±0.012a0.681±0.038a0.717±0.016a67.34 0.000 0.496±0.021 0.653±0.016a0.705±0.042a0.734±0.039a91.93 0.000 0.464±0.017 0.671±0.024a0.726±0.039a0.723±0.048a147.66 0.000

2.2 PCA對細(xì)胞模型凋亡的影響 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測PCA對模型細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，Aβ1-42模型組凋亡率明顯上升，與PCA組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見圖1)。

圖1 PCA對細(xì)胞模型凋亡的保護(hù)作用

2.3 PCA對ERK蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot檢測PCA對ERK蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，Aβ1-42模型組ERK蛋白表達(dá)下調(diào)，PCA各實(shí)驗(yàn)組ERK蛋白表達(dá)上調(diào)。

圖2 PCA對ERK蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

當(dāng)前，我國人口進(jìn)入老齡化階段，阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。AD的發(fā)病機(jī)理很復(fù)雜，其中Aβ(β-amyloid protein)級(jí)聯(lián)學(xué)說認(rèn)為，淀粉前體樣蛋白(Amyloid precursor protein，APP)的酶切代謝產(chǎn)物Aβ在AD發(fā)病早期起主要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aβ1-42寡聚體致使海馬神經(jīng)元活力下降，神經(jīng)元凋亡增加，ERK表達(dá)下降，而原兒茶酸可以有效的改善海馬神經(jīng)元的活力，減少神經(jīng)元凋亡，增加ERK表達(dá)。由此可以說明，原兒茶酸對Aβ1-42寡聚體損傷的海馬神經(jīng)元具有一定保護(hù)作用。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal regulated kinase，ERK)參與細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑的一類信號(hào)分子，與AD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，與海馬區(qū)學(xué)習(xí)記憶功能有密切聯(lián)系[3]。ERK屬于一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族的一個(gè)重要成員，ERKl、 ERK2分子量分別為44 kD和42 kD。MEK(MAP kinase kinase)為MAP2K家族成員，有MEK1和MEK2兩種亞型，分子質(zhì)量分別為44 kD和45 kD，通過磷酸化酪氨酸/蘇氨酸(Tyr/Thr)殘基，進(jìn)而激活下游底物ERK1/2。ERK下游的MAPKAPK主要是90 kD核糖體S6激酶，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核并磷酸化一系列底物，如c-Fos、帽結(jié)合蛋白(Cap binding protein，CBP)等[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元損傷發(fā)生后，ERK在神經(jīng)損傷的區(qū)域激活，減少細(xì)胞凋亡，從而縮小創(chuàng)傷范圍，降低對機(jī)體的影響[5]。本研究結(jié)果顯示Aβ1-42寡聚體可以增加海馬神經(jīng)元的凋亡率。分子生物學(xué)機(jī)制的研究結(jié)果表明，加入Aβ1-42寡聚體24 h后，海馬神經(jīng)元ERK蛋白表達(dá)水平下降；給予原兒茶酸干預(yù)后，ERK蛋白表達(dá)水平升高。結(jié)果提示，Aβ1-42寡聚體可造成海馬神經(jīng)元的損傷，而神經(jīng)元損傷的機(jī)制可能與ERK信號(hào)通路有關(guān)，并且原兒茶酸的神經(jīng)保護(hù)作用可能參與ERK蛋白的表達(dá)。

綜上所述，原兒茶酸對Aβ1-42寡聚體誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，且原兒茶酸的藥物作用機(jī)制與ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。因此，益智仁提取物-原兒茶酸在AD治療中具有一定的潛在應(yīng)用價(jià)值，但其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

[1]Zhang X,Shi GF,Liu XZ,et al.Anti-ageing effects of protocatechuic acid from Alpinia on spleen and liver antioxidative system of senescent mice[J].Cell Biochem Funct,2011,29(4):342-347.

[2]李智勇,夏 鷹,陳曉東,等.益智仁提取物原兒茶酸對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].海南醫(yī)學(xué),2013,24(2): 157-159.

[3]吳 哲,趙艷華,彭 博,等.堿性成纖維細(xì)胞生長因子對AD細(xì)胞模型ERK1/2活性的影響[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2011,17(3): 300-303.

[4]趙明哲,劉靖華,李玉花,等.ERK信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志,2009,29(1):15-19.

[5]陶 昕,孟祥志,孫 麗,等.MAPK信號(hào)通路與神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究進(jìn)展[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2010,16(6):574-577,582.

Protective effect of protocatechuic acid on AD hippocampl neurons treated with Aβ1-42oligomer.

LI Zhi-yong1, LUO Han1,ZHANG Hai-ying2.1.Department of Neurosurgery,Haikou People's Hospital,Haikou 570208,Hainan, CHINA;2.Department of Anatomy,Hainan Medical University,Haikou 571101,Hainan,CHINA

ObjectiveTo study the effect of protocatechuic acid(PCA)fromAlpinia oxyphyllain Hainan on nerve cell injury models,which were established by incubating hippocampl neurons of SD fetal rats in the presence ofβ-amyloid 1-42(Aβ1-42)oligomer.MethodsWith cell viability detected by MTT,apoptosis detected by flow cytometry and ERK protein detected by Western blot,the protective effect of PCA on nerve cell injury models was observed.ResultsAfter intervention by Aβ1-42oligomer.the viability of hippocampl neurons were decreased;The apoptotic rate increased;ERK protein expression was down-regulated.However,after the addition of PCA,the viability of hippocampl neurons significantly improved and the apoptotic rate significantly reduced,with dose-dependent effect.The expression of ERK protein was also up-regulated.ConclusionPCA had a significant protective effect against Aβ1-42oligomer-induced injury.

Alzheimer's disease;Aβ1-42oligomer;Protocatechuic acid(PCA);ERK signal pathway

R-332

A

1003—6350（2015）14—2029—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0735

2015-01-12)

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81100246)；海南省自然科學(xué)基金(編號(hào)：811204)；?？谑兄攸c(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2011-0135)

張海英。E-mail：hyzhang_xjtu@yahoo.cn