王夢龍，劉劍芳，劉夢林，馮 穎，袁文慧，萬 軍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

瘦素在心衰患者心肌中的表達(dá)及其與心肌炎癥反應(yīng)的相關(guān)性

王夢龍，劉劍芳，劉夢林，馮 穎，袁文慧，萬 軍

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

目的 探討瘦素(Leptin)在心力衰竭患者心肌中的表達(dá)及意義。方法收集行心臟移植的心力衰竭患者左心室心肌樣本20例，同時收集配型不成功的供體心肌樣本(對照組)9例，分別檢測心肌組織中Leptin、B型利鈉肽(NPPB)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達(dá)水平，并分析Leptin與NPPB、IL-6及TNF-α含量的相關(guān)性。結(jié)果與對照組比較，心衰患者心肌組織Leptin mRNA和蛋白水平明顯上調(diào)(P＜0.01)，NPPB、IL-6及TNF-αmRNA水平升高；相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)心衰患者心肌Leptin mRNA表達(dá)水平與心力衰竭嚴(yán)重程度(NPPB)、心肌炎癥反應(yīng)程度(IL-6和TNF-α)均呈正相關(guān)(r=0.804，P＜0.01；r=0.457，P＜0.05；r=0.336，P＜0.05)。結(jié)論心衰患者心肌組織Leptin表達(dá)水平增高，且與心肌炎癥反應(yīng)程度相關(guān)；Leptin可能通過調(diào)節(jié)心肌炎癥反應(yīng)參與心衰后心肌重構(gòu)過程。

瘦素；心力衰竭；炎癥反應(yīng)；心肌重構(gòu)

瘦素(Leptin)是最早被發(fā)現(xiàn)的脂肪細(xì)胞合成和分泌的細(xì)胞因子[1]，具有調(diào)節(jié)能量代謝的作用，血漿Leptin濃度與體重指數(shù)和肥胖程度正相關(guān)[2]。隨后證實其他組織如腦、骨骼肌、胎盤、心臟等組織同樣可以合成和分泌Leptin[3-4]，通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)臟器功能。現(xiàn)有的研究提示血清Leptin水平與心肌梗死[5]、高血壓病[6]、卒中[7]等心血管不良事件發(fā)生率相關(guān)。心衰患者循環(huán)血Leptin濃度升高，與心衰患者循環(huán)血炎癥反應(yīng)程度相關(guān)[8-9]，基礎(chǔ)研究證實缺血再灌注等病理刺激可以誘導(dǎo)心肌Leptin表達(dá)[10]，但Leptin在心衰患者心肌組織中的表達(dá)及其與心肌炎癥反應(yīng)程度之間關(guān)系的報道甚少。因此本研究擬通過收集心衰患者左心室心肌組織，檢測心肌Leptin和炎癥指標(biāo)表達(dá)水平并分析其相關(guān)性，以明確Leptin在心衰患者心肌重構(gòu)病理生理過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 心肌標(biāo)本收集 參照之前方法[11]收集2012年9月至2013年12月期間因嚴(yán)重心功能不全行心臟移植患者的左心室心肌組織，所有心衰患者的診斷均符合2012年歐洲心臟病協(xié)會發(fā)布的心衰診斷及治療指南[12]。同時收集配型不成功的供體心臟左心室心肌組織作為對照組，排除有嚴(yán)重肝腎功能不全、心臟病史的供體標(biāo)本。所有標(biāo)本均取左室前壁心肌組織，以最大程度保證樣本的均一性。心肌組織分離后迅速放至液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Real-time PCR檢測心肌Leptin、B型利鈉肽(NPPB)、白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-α) mRNA水平 Trizol法提取心肌組織總RNA，Nanodrop 2000測定RNA濃度，取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用羅氏Light Cycler 480 Real-time PCR儀進行相應(yīng)指標(biāo)的特異性擴增，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法進行定量分析，相應(yīng)試劑購于Roche公司。目標(biāo)基因與內(nèi)參基因的特異性引物序列見表1，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性10 min；95°C變性10 s、60°C退火10 s、72°C延伸20 s，共40個循環(huán)。

表1 實時熒光定量PCR特異性引物序列

1.3 Western blot檢測心肌Leptin蛋白水平 取適量心肌組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照40 μg/孔道上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，之后將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBS中室溫封閉1 h，封閉后用TBST洗膜5 min，共3次。將PVDF膜置于Leptin一抗(Abcam，1:1 000)中4℃孵育過夜。次日使用相應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶，以GAPDH為內(nèi)參分析Leptin表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用獨立樣本t檢驗，Leptin與NPPB、IL-6及TNF-α相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共收集到心衰患者心肌組織20例，均為男性，病因包括擴張型心肌病(DCM，12例)和缺血性心肌病(ICM，8例)，同時共收集到供體心肌組織(對照組)9例。心衰組患者平均年齡大于對照組[(53.55±10.84)vs(38.11±7.70)，t=-4.415，P＜0.01]。心衰組左室舒張末期內(nèi)徑為(67.90±9.69)mm，平均射血分?jǐn)?shù)為(28.80±5.95)%。

2.2 Leptin mNRA及蛋白表達(dá)水平 與對照組相比，心衰組患者心肌中Leptin mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)(升高約4.7倍)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-8.653，P＜0.01)。同樣，Western blot證實Leptin蛋白在心衰患者心肌中表達(dá)水平明顯高于對照組(t=-11.607，P＜0.01，圖1)。

2.3 Leptin mRNA水平與NPPB、IL-6及TNF-α的相關(guān)性 NPPB是編碼B型利鈉肽的基因，其表達(dá)水平可以反映心衰嚴(yán)重程度。NPPB mRNA表達(dá)在心衰組心肌中明顯上調(diào)(圖2)，且心衰患者心肌Leptin mRNA水平與NPPB mRNA水平明顯正相關(guān)(r=0.804，P=0.002)。IL-6、TNF-αmRNA水平一定程度上反映心肌炎癥反應(yīng)程度，在心衰發(fā)生后心肌中兩者表達(dá)水平均增高(圖2)，Spearman關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)Leptin mRNA與IL-6、TNF-αmRNA水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.457，P＜0.05；r=0.336，P＜0.05)。

圖1 心衰組與對照組心肌Leptin表達(dá)水平

注：a心衰組與對照組比較，P＜0.01

圖2 心衰組與對照組心肌NPPB、IL-6及TNF-α mRNA表達(dá)水平

3 討論

心力衰竭發(fā)生后心肌出現(xiàn)一系列結(jié)構(gòu)與功能的改變，稱為心肌重構(gòu)。心肌重構(gòu)的發(fā)生機制尚不完全清楚，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬等多種病理生理過程均參與了心肌重構(gòu)過程。脂肪細(xì)胞因子如脂聯(lián)素、Leptin等具有多功能效應(yīng)的細(xì)胞因子在心血疾病中的作用受到越來越多的關(guān)注。

早期的研究發(fā)現(xiàn)心衰患者血清Leptin水平升高，與心衰患者胰島素抵抗程度相關(guān)[9]，提示Leptin可能在心衰患者能量代謝過程中起重要作用。隨著研究的深入，血清Leptin水平被認(rèn)為是心衰診斷的一個指標(biāo)[13]，可以反映心衰患者炎癥反應(yīng)程度[14-15]。有氧運動可以降低冠心病風(fēng)險，可能與有氧運動降低患者血清Leptin、TNF-α等因子水平有關(guān)[16]?；A(chǔ)研究證實Leptin在心肌肥厚和其他心血管疾病模型中起重要作用[17]。Leptin刺激增加乳鼠心肌細(xì)胞表面面積，促進胚胎基因的表達(dá)，通過p38途徑參與心肌細(xì)胞肥大過程[18]。另外，Leptin還參與AngⅡ刺激和內(nèi)皮素刺激引起的心肌肥厚過程[19]。而抑制Leptin表達(dá)可以降低IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平，改善心肌細(xì)胞和心臟收縮功能[15，20]。這些研究均提示心肌Leptin在心肌病理生理過程中具有重要作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，心衰患者心肌中Leptin mRNA和蛋白表達(dá)水平增高，炎癥反映相關(guān)指標(biāo)IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)水平也增高，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)Leptin水平與心力衰竭嚴(yán)重程度和炎癥反應(yīng)程度正相關(guān)，這與其他學(xué)者在血清標(biāo)本中的研究結(jié)果一致[14-15]。我們推測心肌細(xì)胞合成和分泌的Leptin可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程參與心衰后心肌重構(gòu)過程。

本研究尚存在一些不足，首先，納入研究的標(biāo)本例數(shù)較少，年齡差異較大；其次，我們的研究僅提示心肌Leptin表達(dá)水平與心肌炎癥反應(yīng)程度相關(guān)，但該結(jié)果并不能證實Leptin水平與心肌炎癥反應(yīng)及心肌重構(gòu)之間的因果關(guān)系，尚需進一步動物或細(xì)胞實驗驗證相關(guān)結(jié)果?？傮w來講，心肌Leptin可能通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)參與心衰后心肌重構(gòu)過程中，但具體機制尚需進一步研究。

[1]Zhang Y,Proenca R,Maffei M,et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J].Nature,1994,372 (6505):425-432.

[2]Maffei M,Halaas J,Ravussin E,et al.Leptin levels in human and rodent:measurement of plasma leptin and ob RNA in obese and weight-reduced subjects[J].Nat Med,1995,1(11):1155-1161.

[3]Purdham DM,Zou MX,Rajapurohitam V,et al.Rat heart is a site of leptin production and action[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004,287(6):2877-2884.

[4]Lin J,Barb CR,Matteri RL,et al.Long form leptin receptor mRNA expression in the brain,pituitary,and other tissues in the pig[J]. DomestAnim Endocrinol,2000,19(1):53-61.

[5]Soderberg S,Ahren B,Jansson JH,et al.Leptin is associated with increased risk of myocardial infarction[J].J Intern Med,1999,246 (4):409-418.

[6]de Haro MC,Figueiredo VN,de Faria AP,et al.High-circulating leptin levels are associated with increased blood pressure in uncontrolled resistant hypertension[J].J Hum Hypertens,2013,27(4): 225-230.

[7]Soderberg S,Stegmayr B,Stenlund H,et al.Leptin,but not adiponectin,predicts stroke in males[J].J Intern Med,2004,256(2): 128-136.

[8]Patel JV,Sosin M,Lim HS,et al.Raised leptin concentrations among South Asian patients with chronic heart failure[J].Int J Cardiol,2007,122(1):34-40.

[9]Doehner W,Rauchhaus M,Godsland IF,et al.Insulin resistance in moderate chronic heart failure is related to hyperleptinaemia,but not to norepinephrine or TNF-alpha[J].Int J Cardiol,2002,83(1):73-81.

[10]Matsui H,Motooka M,Koike H,et al.Ischemia/reperfusion in rat heart induces leptin and leptin receptor gene expression[J].Life Sci,2007,80(7):672-680.

[11]王夢龍,萬 軍,劉劍芳,等.IL-10在心力衰竭患者心肌中的表達(dá)及其與心肌氧化應(yīng)激關(guān)系的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2014,43 (10):103-106.

[12]McMurray JJ,Adamopoulos S,Anker SD,et al.ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA)of the ESC[J].Eur Heart J,2012,33(14):1787-1847.

[13]Lieb W,Sullivan LM,Harris TB,et al.Plasma leptin levels and incidence of heart failure,cardiovascular disease,and total mortality in elderly individuals[J].Diabetes Care,2009,32(4):612-616.

[14]Straburzynska-Migaj E,Gwizdala A,Siniawski A,et al.Leptin and inflammation in patients with chronic heart failure[J].Kardiol Pol, 2010,68(11):1243-1247.

[15]Bobbert P,Jenke A,Bobbert T,et al.High leptin and resistin expression in chronic heart failure:adverse outcome in patients with dilated and inflammatory cardiomyopathy[J].Eur J Heart Fail,2012,14 (11):1265-1275.

[16]Akbarpour M.The effect of aerobic training on serum adiponectin and leptin levels and inflammatory markers of coronary heart disease in obese men[J].Biol Sport,2013,30(1):21-27.

[17]Karmazyn M,Rajapurohitam V.Leptin as a cardiac pro-hypertrophic factor and its potential role in the development of heart failure [J].Curr Pharm Des,2014,20(4):646-651.

[18]Rajapurohitam V,Gan XT,Kirshenbaum LA,et al.The obesity-associated peptide leptin induces hypertrophy in neonatal rat ventricular myocytes[J].Circ Res,2003,93(4):277-279.

[19]Rajapurohitam V,Javadov S,Purdham DM,et al.An autocrine role for leptin in mediating the cardiomyocyte hypertrophic effects of angiotensinⅡand endothelin-1[J].J Mol Cell Cardiol,2006,41(2): 265-274.

[20]Moro C,Grauzam S,Ormezzano O,et al.Inhibition of cardiac leptin expression after infarction reduces subsequent dysfunction [J].J Cell Mol Med,2011,15(8):1688-1694.

Expression of Leptin in the myocardium of patients with heart failure and its relationship with inflammation.

WANG Meng-long,LIU Jian-fang,LIU Meng-lin,FENG Ying,YUAN Wen-hui,WAN Jun.Department of Cardiology, Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and significance of Leptin in the myocardium of patients with heart failure and its relationship with inflammation.MethodsLeft ventricular tissues were collected from 20 transplanted hearts with heart failure(n=20,the study group)and 9 donor hearts which were not matched with patients(n=9,the control group).Expression levels of Leptin,natriuretic peptide precursor B(NPPB),interleukin-6 (IL-6)and tumor necrosis factor(TNF-α)in the myocardium were detected.Spearman analysis was applied to test the correlations between mRNA levels of Leptin and NPPB,IL-6,TNF-α.ResultsCompared with control group,the mRNA and protein levels of Leptin in the study group was significantly increased(P＜0.01).Also,the mRNA levels of NPPB,IL-6,TNF-αwere significantly higher than those in the control group.The mRNAlevels of Leptin was positively correlated with NPPB,IL-6 and TNF-αmRNA levels in the myocardium of patients with heart failure(r=0.804,P＜0.01;r=0.457,P＜0.05;r=0.336,P＜0.05).ConclusionThe expression of Leptin is increased at both mRNA and protein levels in the myocardium of patients with heart failure,and Leptin levels are positively correlated with the severity of inflammation.Leptin may play an important role during cardiac remodeling through regulating inflammation process.

Leptin;Heart failure;Inflammation;Cardiac remodeling

R541.6

A

1003—6350（2015）14—2040—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.14.0738

2015-04-15)

國家自然科學(xué)基金(編號：81170208)；湖北省科技廳項目(編號：302-131725)

萬 軍。E-mail：wanjun1963@126.com