朱敏，李寶坤，李開雄，盧士玲，王慶玲，蔣彩虹，樊哲新，蔣琰潔，趙冠東

1(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子，832000)2(陜西華秦農(nóng)牧科技有限公司，陜西楊凌，712100)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類革蘭氏染色呈陽性的桿菌或球菌，對葡萄糖發(fā)酵能產(chǎn)生50% 以上乳酸的一類微生物的總稱［1］。在乳酸菌中，乳酸桿菌是最大的一個屬，是目前發(fā)酵產(chǎn)品市場中重要的發(fā)酵劑，也是一種頗受關(guān)注的益生菌，具有重要的經(jīng)濟價值。由于外界各種不良環(huán)境的脅迫及不利因素的影響，嚴(yán)重地限制了乳酸桿菌的生長及代謝能力，進而影響了益生功能的發(fā)揮，抑制了高效活性的利用［2］。從生理或分子生物學(xué)的角度了解脅迫耐受性的機制是必要的，脅迫可定義為能引起生長速率或存活率降低的基因、蛋白或環(huán)境方面的一種變化［3］。在實際應(yīng)用過程中，菌體所經(jīng)歷的脅迫環(huán)境往往是復(fù)雜和交互的。發(fā)酵制品如酸馬奶酒、葡萄酒、發(fā)酵乳飲料等都由乳酸菌與酵母菌共同發(fā)酵而成［4］，其發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，造成生存環(huán)境不斷地改變，菌體不可避免的受到各種脅迫條件的影響，如溫度、pH、乙醇、滲透壓等，其中乙醇是最常見的脅迫因子之一［5］。一般體積分?jǐn)?shù)4%的乙醇含量就可抑制菌體的生長速率［6］。李愛霞［7］，秦偉帥［8］等研究發(fā)現(xiàn)乙醇濃度過高就會影響菌體的新陳代謝、生理活性等。Graca等［9-10］研究認(rèn)為，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%～10%的條件下，細(xì)菌的生長會受到明顯抑制，12.5%以上的乙醇不僅抑制細(xì)菌的生長，甚至?xí)斐删w的大量死亡［11］。乙醇屬有機溶劑，對菌體的毒害主要表現(xiàn)在對細(xì)胞膜的破壞上，乙醇滲入膜結(jié)構(gòu)改變它們的組織和功能，影響基體的酶活性［12］，增加細(xì)胞膜的通透性，造成胞內(nèi)物質(zhì)流失［13］，關(guān)鍵酶變性失活，致使正常生理代謝調(diào)控失常，存活率降低。目前對于乳酸桿菌在乙醇脅迫條件下的生理狀態(tài)研究頗少。探究乙醇脅迫對乳酸桿菌的損傷機理，確定乙醇脅迫后影響菌體正常代謝的關(guān)鍵酶是很有必要的。本文以面包乳桿菌(Lactobacillus crustorum D2-5)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum D5-5)作為研究對象，分別選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%和8%進行脅迫處理與不加乙醇的樣品進行菌種活力的對比，測定乙醇脅迫處理后菌體存活率及乙醇脅迫對糖酵解過程中關(guān)鍵酶的影響，分析乙醇脅迫造成菌體失活的主要因素，并對其機理進行探究。

1 材料與方法

1.1 原料

面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5均來自石河子大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)實驗室;培養(yǎng)基MRS;考馬斯亮藍(lán)G-250;己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶試劑盒，均由南京建成生物公司提供;無水乙醇及其他試劑，均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見光分光光度計，鄭州中譜儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機，力康發(fā)展有限公司;電子分析天平，上海第三天平儀器廠;生物培養(yǎng)箱，上海精密誓言設(shè)備有限公司;高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;渦旋振蕩器，金壇市醫(yī)療儀器廠;超聲破碎儀，南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫對乳酸桿菌存活率的測定

收集對數(shù)生長末期的菌體，離心(4℃，10 000 r/min，5 min)。細(xì)胞經(jīng)0.85%的生理鹽水洗滌2次后重懸于等體積不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的MRS培養(yǎng)基中，脅迫2 h。脅迫后的菌懸液經(jīng)0.85%的生理鹽水洗滌2次后重懸于等體積生理鹽水中，取1 mL重懸液，稀釋不同梯度涂布于平板上測定存活率。37℃下培養(yǎng)24 h，實驗重復(fù)3次，每次3個平行樣品。

式中:NA為未添加乙醇的活菌數(shù);NB為不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫后的活菌數(shù)［14］。

1.3.2 己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、ATP酶的測定

1.3.2.1 無細(xì)胞提取液的制備

菌體活化后，按2%的接種量分別接到體積分?jǐn)?shù)為5%、8%的乙醇液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，體積分?jǐn)?shù)為離心(4℃，4 000 r/min，10 min)收集生長至對數(shù)末期的菌體，用無菌磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 7.4)或0.85%生理鹽水洗滌2次。取4 mL在冰水浴中進行超聲破碎(工作時間∶間歇時間=3s∶9s)，持續(xù)5 min。離心(4 ℃，6 000 r/min，10 min)，取其上清液用于相關(guān)酶活性的測定［2］。

1.3.2.2 蛋白質(zhì)的測定

考馬斯亮藍(lán)染色法［15］。

1.3.2.3 相關(guān)酶活性的測定

己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、ATP酶均采用南京建成生物公司相應(yīng)的試劑盒進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件作圖，SPSS數(shù)據(jù)處理軟件Oneway ANOVA法對實驗數(shù)據(jù)進行方差顯著性分析，P＜0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫對乳酸桿菌存活率的影響

經(jīng)不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫培養(yǎng)條件下，收集對數(shù)末期的菌體，觀察菌體的生長情況如圖1所示。本研究通過乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、8%脅迫處理后，以不加乙醇的樣品作為對照。由圖1可以看出，乳酸桿菌在5%乙醇脅迫處理后，相對于對照來說，面包乳桿菌D2-5與植物乳桿菌D5-5存活率分別提高了27.11%和17.20%。但是體積分?jǐn)?shù)為8%乙醇脅迫處理后，存活率明顯下降，面包乳桿菌D2-5、植物乳桿菌D5-5存活率僅為26.61%和23.50%。這一結(jié)果說明，5%乙醇脅迫處理提高了菌體的存活率，使得細(xì)胞膜的通透性增加，促進細(xì)胞內(nèi)外質(zhì)子或其他離子的交換，增強了菌體新陳代謝的能力［16］，進而使得菌體存活率提高。而8%乙醇脅迫處理對菌體的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，生長速率及存活率明顯降低。

2.2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫處理后對乳酸桿菌己糖激酶(HK)的影響

己糖激酶廣泛存在于動植物及和微生物體內(nèi)，作用于D-葡萄糖、果糖和甘露糖，是糖酵解過程中的第1個調(diào)節(jié)酶，其活性大小與乳酸菌的糖代謝速率相關(guān)。規(guī)定在37℃，pH 7.6的條件下，1 mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 mmol的NADPH定義為1個酶活力單位。本研究測定不同乙醇濃度脅迫處理后對其活力的影響，研究結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫的乳酸桿菌隨著乙醇濃度的升高，己糖激酶活力有所降低，效果不顯著。不同的乳酸桿菌之間存在個體差異性，在5%乙醇脅迫處理條件下，植物乳桿菌D5-5酶活力稍微高于未加乙醇的對照。乙醇脅迫處理之前己糖激酶活力為(4.51±0.50)U，而脅迫之后卻為(4.72±0.94)U相對于未經(jīng)乙醇脅迫的對照組來說，均不具有顯著性。酶活力的變化與菌體活力相關(guān)，在8%乙醇脅迫處理條件下，2株乳桿菌均具有極顯著性差異(P＜0.01)，其酶活分別為(4.54±0.75)U，(3.12±0.19)U。8%脅迫處理后細(xì)胞明顯受到損傷，致使其活力下降。這一結(jié)果表明己糖激酶不是乙醇脅迫乳酸菌代謝的主要酶。

2.3 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫處理后對乳酸桿菌丙酮酸激酶(PK)的影響

丙酮酸激酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，磷酸烯醇式丙酮酸的高能磷酸鍵在催化下轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP，自身生成烯醇式丙酮酸后自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)楸?。反?yīng)不可逆。它是糖酵解途徑中第二個以底物水平磷酸化方式生成ATP的反應(yīng)。丙酮酸激酶是糖酵解途徑中的又一個限速酶。定義為在37℃，pH 7.6的條件下，1 mg組織蛋白每分鐘將1 μmol的PEP轉(zhuǎn)變成丙酮酸為1個酶活力單位。本研究測定不同乙醇濃度脅迫處理后對其活力的影響，研究結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫條件下丙酮酸激酶活力有顯著性差異，對于植物乳桿菌D5-5來說，5%乙醇脅迫后的酶活力明顯高于未添加乙醇的對照。脅迫處理后酶活約為(16.74±1.75)U，而未加乙醇中的對照約為(9.29±0.98)U，其活力提高了約80.19%。不同菌株耐乙醇能力的不同，有些菌株在5%乙醇脅迫條件下能促進菌體的生長［17］，增加細(xì)胞膜的通透性，加快物質(zhì)的代謝能力，使其酶活力增強。而對于面包乳桿菌D2-5來說，脅迫處理后的菌體酶活下降了45.96%，乙醇脅迫處理影響細(xì)胞膜選擇性維護功能，抑制相關(guān)物質(zhì)代謝的運輸過程，導(dǎo)致酶活力下降［12］，使5%乙醇脅迫效果達到極顯著水平(P＜0.01)。在8%乙醇脅迫條件下，對于面包乳桿菌D2-5來說，乙醇脅迫效果達到極顯著水平(P＜0.01)，脅迫處理后酶活約為(5.52±0.45)U，而未添加乙醇的對照卻約為(12.25±1.32)U。對于植物乳桿菌D5-5來說，乙醇脅迫效果達到了顯著水平(P＜0.05)。8%乙醇脅迫明顯抑制菌體的生長，活力有所降低，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5酶活分別降低了54.94%、10.55%。這一結(jié)果說明，丙酮酸激酶是乙醇脅迫損傷的關(guān)鍵代謝酶。

2.4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫處理后對乳酸桿菌乳酸脫氫酶(LDH)的影響

乳酸脫氫酶是一種廣泛存在于各種生物體中的酶，將丙酮酸催化還原為乳酸。乳酸脫氫酶活力大小，反應(yīng)了菌株的產(chǎn)酸能力。定義為1 g組織蛋白37℃與基質(zhì)作用15 min，反應(yīng)體系中產(chǎn)生1 μmol丙酮酸為1單位(U/μg蛋白)。本研究測定不同乙醇脅迫處理后乳酸脫氫酶活力的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫乳酸桿菌乳酸脫氫酶活明顯低于脅迫之前，并隨著乙醇濃度的升高而降低。與未添加乙醇的對照相比，在5%乙醇脅迫條件下，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5酶活分別降低了21.88%、20.00%。而在8%乙醇脅迫條件下，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5酶活分別降低了40.63%、37.50%。通過方差分析可知，5%、8%乙醇脅迫均對乳酸脫氫酶影響極顯著(P＜0.01)。這一結(jié)果說明乳酸脫氫酶是乙醇脅迫過程中造成乳酸菌損傷的關(guān)鍵酶。

2.5 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)脅迫處理后對乳酸桿菌ATP酶的影響

ATP酶是廣泛分布的生物膜酶系統(tǒng)，主要維持細(xì)胞的正常生理功能，是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶是2種重要的ATP酶，它們對維持細(xì)胞的正常生理功能有著極其重要的作用，Na+-K+-ATP酶是鑲嵌在細(xì)胞質(zhì)膜脂質(zhì)雙分子層中的一種蛋白質(zhì)，具有載體和酶的活性，它們催化ATP水解，驅(qū)動Na+和K+于細(xì)胞膜兩側(cè)的對向運輸，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Na+、K+的濃度，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓從而保持細(xì)胞的靜息電位［18］。Ca2+-Mg2+-ATP酶是另一種重要的膜酶，主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi) Ca2+和 Mg2+的濃度［14］。本研究測定不同乙醇脅迫處理后對乳酸菌ATP酶的影響，規(guī)定每小時每微克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位(U/μg蛋白)。結(jié)果如圖5所示，圖 a為 Na+-K+-ATP酶，圖 b為Ca2+-Mg2+-ATP酶。

由圖5可以看出，在不同乙醇濃度脅迫條件下ATP酶活力有極顯著性差異，對于兩種乳桿菌來說，經(jīng)5%、8%乙醇脅迫后 Na+-K+-ATP酶和 Ca2+-Mg2+-ATP酶相對于未經(jīng)乙醇脅迫均具有極顯著性差異(P＜0.01)。對于Na+-K+-ATP酶來說，面包乳桿菌D2-5和植物乳桿菌D5-5均隨著乙醇濃度的升高，活力依次降低。經(jīng)5%乙醇脅迫后活力分別降低了53.53%、64.44%，而8%乙醇脅迫酶活力分別降低了56.57%、81.11%。對于Ca2+-Mg2+-ATP酶來說，植物乳桿菌D5-5經(jīng)5%、8%乙醇脅迫后，酶活力分別降低了46.67%、78.33%，但是由于菌種之間存在差異性，面包乳桿菌D2-5在5%乙醇脅迫過程中，Ca2+-Mg2+-ATP酶活力升高了35.42%，8%乙醇脅迫后降低了42.71%，說明在5%乙醇脅迫處理后菌體細(xì)胞膜的通透性增大，物質(zhì)代謝能力增強，致使其酶活力偏高。這一結(jié)果表明ATP酶是乙醇脅迫乳酸桿菌過程中另一關(guān)鍵酶。

3 討論

酵母進行乙醇發(fā)酵過程中，自身產(chǎn)生乙醇，達到一定濃度時，對酵母本身具有毒性，當(dāng)然對與之相互作用的乳酸菌來說，更是不可避免。不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對菌體細(xì)胞損傷程度不同。乙醇脅迫可能同時作用或者連續(xù)作用，抑制菌體生長及發(fā)酵能力，影響菌體的存活率，降低發(fā)酵效率［19］。研究表明，不同菌株對乙醇的耐受性不同，菌株的乙醇耐受性與細(xì)胞膜的特性及內(nèi)部環(huán)境有關(guān)［2］。本文采用不同濃度對不同乳酸桿菌進行脅迫處理，結(jié)果表明5%乙醇脅迫處理有助于提高菌體存活率，但是效果不顯著。在此脅迫過程中，乙醇可能促使細(xì)胞膜的通透性增大，物質(zhì)代謝速率加快，反而會促進菌體生長，代謝酶活力提高。8%乙醇脅迫處理后，存活率明顯下降，菌體的生長受到嚴(yán)重抑制，致使相關(guān)酶活力降低。這一結(jié)果與李愛霞［6］，陳偉帥［7］，Graca da Silveira 等［9-10］等研究結(jié)果一致，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過8% ～10%時，就會明顯抑制乳酸菌的生長。乙醇作為有機溶劑具有親水性的同時又涉及本身的固有毒性。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇侵入細(xì)胞時，最先停留在細(xì)胞膜上，引起細(xì)胞膜表面性質(zhì)的改變，如總能量的狀態(tài)、主動運輸系統(tǒng)及膜結(jié)構(gòu)的變化等［20］。同時乙醇具有很強的滲透能力，可以直接進入菌體內(nèi)部，破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，在等電點時使蛋白質(zhì)沉淀，破壞了蛋白質(zhì)構(gòu)象，進而引起蛋白質(zhì)變性。研究探討的己糖激酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶均屬于蛋白酶，乙醇侵入會直接破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶蛋白變性，而使酶活力降低。乙醇對乳桿菌脅迫處理是一個比較復(fù)雜的過程，乙醇脅迫機理及菌體生長過程涉及影響因素頗多，進而乙醇脅迫對乳桿菌代謝活力的影響有待進一步探究。研究乳桿菌生長的過程中乙醇脅迫損失的關(guān)鍵因素，并采取有效可行的保護策略，為提高工業(yè)發(fā)酵過程中菌體存活率提供理論依據(jù)，更為工業(yè)化生產(chǎn)一體化奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

(1)在乙醇脅迫處理過程中，5%乙醇脅迫處理有助于提高菌體存活率，但是效果不顯著。在5%乙醇脅迫條件下，面包乳桿菌D2-5與植物乳桿菌D5-5存活率分別提高了27.11%和17.20%。

(2)8%乙醇脅迫處理后，存活率明顯下降，面包乳桿菌D2-5與植物乳桿菌D5-5僅為26.61%、23.50%。菌體的生長受到嚴(yán)重抑制，致使相關(guān)酶活力降低。

(3)乙醇脅迫處理對乳酸桿菌己糖激酶的影響不顯著，而對丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶具有顯著或極顯著性差異。這一結(jié)果說明，丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶及ATP酶是乙醇脅迫影響菌體損失的關(guān)鍵酶，而酶活力的變化與菌體的活力相關(guān)。

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