尹禮國，馬偉玲，李文芳，楊婧，梁會朋，張其圣，，陳功，吳正云，張文學(xué)

1(宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓，644007)

2(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，四川成都，610065)

3(宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓，644007)

4(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川成都，611130)

國內(nèi)外學(xué)者對發(fā)酵蔬菜的微生物生態(tài)研究表明，乳酸菌、酵母菌是發(fā)酵蔬菜中的優(yōu)勢菌群，乳酸菌通過產(chǎn)酸降低pH值，抑制腐敗微生物的生長，酵母菌在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇、酯類等物質(zhì)，可賦予發(fā)酵蔬菜良好的風(fēng)味。張鵬［1］、鄯晉曉［2］、曾駿［3］等開展了泡菜增香酵母菌的分離、鑒定及應(yīng)用。羅松明等［4］采用微生物培養(yǎng)技術(shù)對四川地區(qū)16份企業(yè)鹽漬水樣品微生態(tài)研究表明，大多數(shù)泡菜樣品的酵母菌含量為103～106CFU/mL。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)能獲得的微生物僅占自然界微生物的1% ～10%，操作步驟繁瑣，無法反映樣品的真實(shí)菌群結(jié)構(gòu)［5-6］。變性梯度凝膠電泳技術(shù)(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)是一項(xiàng)研究微生物生態(tài)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，1993年由Muyzer等［7］首次應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，不需培養(yǎng)分離微生物，直接提取樣品DNA，對目的片段擴(kuò)增后電泳分析獲得菌群結(jié)構(gòu)信息。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于土壤、海洋、胃腸道、菌肥、廢水、污泥、發(fā)酵食品的菌群結(jié)構(gòu)研究。1999年，Ampe等［8］首次采用DGGE技術(shù)研究食品菌群結(jié)構(gòu)，隨后許多科學(xué)家采用該技術(shù)對發(fā)酵面團(tuán)、葡萄酒、香腸、韓國泡菜等發(fā)酵食品的菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。

四川地區(qū)的鹽漬青菜，俗稱酸菜，是泡菜加工企業(yè)的主要產(chǎn)品之一，是以當(dāng)?shù)胤Q為青菜的葉用芥菜(Brassica juncea)鹽漬發(fā)酵而成的腌漬菜，是制作酸菜魚底料、老壇酸菜方便面調(diào)味料、下飯菜及其他調(diào)味料、菜品的重要原料。與家庭傳統(tǒng)泡菜不同的是，為了達(dá)到長期貯藏蔬菜的目的，腌漬過程中的食鹽添加量達(dá)10%左右。開展鹽漬青菜微生物菌群結(jié)構(gòu)研究，對生產(chǎn)管理、降低食鹽用量、降低生產(chǎn)成本等具有指導(dǎo)意義。本文采用DGGE技術(shù)對取自生產(chǎn)車間的鹽漬青菜的真菌菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，對分離培養(yǎng)得到的酵母菌進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定，并對2種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了對比分析。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

用無菌取樣瓶取鹽漬青菜(2013年3月19日取自四川省眉山市吉香居、李記食品廠)，樣品取回后保存于-20℃冰箱中，及時(shí)提取總DNA。1、2號樣品為青菜的桿、葉，購自農(nóng)貿(mào)市場;3、4、5號樣品為鹽漬2個(gè)月、14個(gè)月、26個(gè)月的青菜桿部，6、7、8號樣品為鹽漬26個(gè)月、14個(gè)月、2個(gè)月的青菜的葉部。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)藥品

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、UNIQ-10核酸純化套件、2×Taq PCR MasterMix、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、十二烷基磺酸鈉、尿素、SYBEGREENⅠ(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

高速冷凍離心機(jī)、超凈工作臺、TECHNE TC-412 PCR儀(TECHNE公司);DYY-5電泳儀(北京六一);凝膠成像儀(Bio-Rad，USA);Bio-rad T1000梯度PCR儀、變性梯度凝膠電泳裝置(Bio-Rad，USA)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 鹽漬青菜總DNA的提取

取鹽漬青菜樣品于冰袋表面解凍，用無菌研缽搗碎得鹽漬汁液。取汁液1mL于1.5 mL離心管，10 000 g離心5 min，去上清液，加入500μL裂解液(100 mmol/L Tris-Cl，5 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，1%SDS，pH 7.5)懸浮樣品，在 -20 ℃反復(fù)凍融3次，加入20μL蛋白酶溶液(20 mg/mL)于56℃水浴60 min。向離心管中加入200 μL無水乙醇，混勻，用UNIQ-10核酸純化柱套件純化得總DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 真菌26S rDNA D2區(qū)擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增引物［9］:反向引物 NL3A(GAGACCGATAGCGAACAAG)、正向引物NL4A-GC(CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGGTCCGTGTTTCAAGACGG)均由上海生工合成，擴(kuò)增目的片斷大小為320bp。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，樣品總 DNA4 μL，上游引物 NL4A-GC(10 μmol/L)和下游引物 NL3A(10 μmol/L)各 2 μL，2 × Taq PCR MasterMix 25 μL，無菌超純水 17 μL。PCR 擴(kuò)增程序，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。所得產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳。

1.4.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE分析與測序

制備變性劑(尿素與甲酰胺)線性梯度30% ～60%的8%(W/V)聚丙烯酰胺(37.5∶1，W/W)凝膠，安裝好儀器后，移取擴(kuò)增產(chǎn)物40 μL于點(diǎn)樣孔中。在溫度為60℃條件下，200 V電泳4 h，取出凝膠，用SYBER GREEN I溶液染色20 min，置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。在紫外防護(hù)下，將優(yōu)勢條帶切割下來，送上海生工克隆測序，在NCBI網(wǎng)站利用BLAST比對鑒定。

1.5 酵母菌分離與鑒定

1.5.1 酵母菌分離與形態(tài)觀察

在無菌條件下取鹽漬青菜研磨，取5 mL汁液于50 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為120 r/min、28℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h。用無菌生理鹽水將富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液稀釋，得 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的不同梯度稀釋液。分別取 10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋液各 0.2 mL 涂布于 YPD固體平板培養(yǎng)基中，放于30℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每個(gè)梯度做2個(gè)平行。將其中具有典型酵母菌菌落特征的菌株挑出，在另一個(gè)YPD固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，鏡檢，反復(fù)2～3次，得到純化的單菌落。

1.5.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

1.5.2.1 總DNA的提取

將酵母菌活化培養(yǎng)后，接種于液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16～24 h，吸取1.5 mL菌液于1.5 mL離心管中，采用Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，置于-20℃保存。

1.5.2.2 18S rDNA的擴(kuò)增與測序

酵母菌18S rDNA的擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL，模板 DNA 4 μL，引物 EF3(10 μmol/L)、EF4(10 μmol/L)各2 μL，2 × TaqPCRMasterMix 25 μL，無菌超純水 17 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，48℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min，4℃保存10 min。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將擴(kuò)增成功的樣品送上海生工測序，測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對分析。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將所得的序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比較，用Clustal 1.83和MEGA5.0進(jìn)行相似性分析及做系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap為1 000，建樹類型為鄰接法(neighbor-joining)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽漬青菜真菌菌群的DGGE分析

依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.4.1提取各鹽漬青菜樣品總DNA，擴(kuò)增真菌26S rDNA D2區(qū)，采用DGGE分析，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，鹽漬青菜中真菌的基因多樣性豐富，各樣品之間呈現(xiàn)一定的規(guī)律變化，隨著鹽漬時(shí)間的延長，優(yōu)勢條帶數(shù)量增多。鹽漬2個(gè)月的青菜桿與葉的真菌生物量相對較少，b、c、d等條帶生物量低，而腌漬14個(gè)月與26個(gè)月的青菜的b、c、d等條帶優(yōu)勢明顯，依此推斷這3個(gè)條帶對應(yīng)的微生物在腌漬菜的成熟過程中可能發(fā)揮著十分重要的作用。采用QUANTITIY ONE軟件的complete linkage聚類方法作系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖2所示，各列之間的相似性矩陣如表1所示。

由圖2可知，青菜桿與青菜葉聚于1個(gè)小分支，與鹽漬2個(gè)月的青菜桿與青菜葉聚于一個(gè)大分支。鹽漬14個(gè)月的青菜桿和葉、鹽漬26個(gè)月的青菜和桿分別聚于一個(gè)小分支，4個(gè)樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)聚于一個(gè)大分支。由圖2與表1可知，各鹽漬青菜樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)的相似度與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果一致。

由于青菜鹽漬過程中添加的食鹽比例高達(dá)10%左右，乳酸發(fā)酵產(chǎn)酸，抑制了真菌的生長，因此，鹽漬2個(gè)月的青菜桿、葉與原料的相似度較鹽漬14個(gè)月與26個(gè)月的高;經(jīng)過長期的腌漬后，耐鹽耐酸微生物生長繁殖，占據(jù)優(yōu)勢，由于高鹽、高酸環(huán)境的抑制作用，生長緩慢，因此在很長時(shí)間內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。

2.2 DGGE條帶的序列分析

對DGGE圖譜中的優(yōu)勢條帶克隆測序、序列比對結(jié)果如表2所示。

由表2可知，鹽漬青菜5個(gè)優(yōu)勢條帶中4個(gè)為酵母菌，另一條帶e與白芥(Sinapis alba)的26S核糖體RNA基因序列相似性最高，推斷這個(gè)序列是源自于青菜［10-11］。另4個(gè)條帶分別與假絲酵母屬(Candida)、德巴氏酵母屬(Debaryomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)的菌株相似。a、d條帶分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號為GU195657、DQ438242的2株假絲酵母屬酵母最為相似，相似度約為99%;b、c條帶分別與NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號為KC442271、JQ689016的Debaryomyces sp.和魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)相似，相似度接近 100%。Dakal等［14］研究指出魯氏接合酵母具有耐糖、耐鹽特性;Wah等［15］研究表明，強(qiáng)化季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermon-dii)與魯氏接合酵母共培養(yǎng)物，可提高泰國豆醬風(fēng)味，楊松彰等［16］報(bào)道分離自優(yōu)質(zhì)醬油的(Candida versatilis CGMCC3790)、魯氏接合酵母 CGMCC3791與乳酸菌共同發(fā)酵可提升郫縣豆瓣醬的品質(zhì)，Cano-Garcia等［17］報(bào)道從自然發(fā)酵香腸中分離得的漢遜德巴氏利酵母具有提高產(chǎn)品香味品質(zhì)的功能。鹽漬青菜中的酵母菌具有耐高滲環(huán)境的特性，部分酵母具有促進(jìn)生香功能。

國內(nèi)外學(xué)者針對發(fā)酵蔬菜的真菌菌群結(jié)構(gòu)也開展了一些研究。張先琴［12］采用DGGE技術(shù)對四川地區(qū)家庭制作泡菜微生物多樣性研究表明，所得真菌序列與(Meyerozyma guilliermondii)和奧默柯達(dá)酵母(Kodamaea ohmeri)的序列具有最高相似度。Chang等［13］采用DGGE技術(shù)對韓國泡菜的酵母菌分析得到的條帶與絲孢酵母屬(Trichosporon)、酵母菌屬(Saccharomyces)、孢堆黑粉菌屬(Sporisorium)、畢赤酵母屬(Pichia)的真菌序列具有最高的相似度。比較可知，不同發(fā)酵蔬菜之間的真菌優(yōu)勢菌有一定的差異性，這是由于微生物菌群結(jié)構(gòu)受到蔬菜品種、來源、預(yù)處理方法及腌漬工藝等因素影響。

2.3 酵母菌分離鑒定

依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.5從鹽漬青菜中分離得到10株酵母菌，通過分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，分離獲得的酵母菌分別與漢遜德巴利酵母、釀酒酵母、魯氏接合酵母相似。對比表2與表3可知，分離得到了與DGGE圖譜優(yōu)勢條帶b、c相似的菌株，未得到條帶a、d所對應(yīng)的酵母菌，這是由于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的偶然性、部分微生物對培養(yǎng)條件的選擇性所致。張鵬［1］從四川泡菜中分離篩選得到2株酵母菌，通過Sher lock微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為粗狀假絲酵母(Candida valida)、平滑假絲酵母(Candida parapsilosis);鄯晉曉［2］從泡菜中分離得到6株，通過生理生化試驗(yàn)初步鑒定為釀酒酵母、粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、粗壯假絲酵母、異變酒香酵母(Torulopsis glabrata)、異常漢遜氏酵母(Hansenula anomala);曾駿［3］從傳統(tǒng)四川泡菜中分離純化得到5株酵母，通過分子生物學(xué)初步鑒定4株為Kazachstania exigua，1株為膜醭畢赤酵母。不同樣品的分離結(jié)果有一定的差異，這是由于樣品的差異與微生物鑒定方法存在的差異所致。

3 結(jié)論

通過PCR-DGGE技術(shù)對真菌菌群結(jié)構(gòu)分析表明，鹽漬青菜的真菌基因多樣性豐富，隨著鹽漬時(shí)間的延長，優(yōu)勢條帶數(shù)量增多，鹽漬2個(gè)月的青菜僅有1條優(yōu)勢條帶，真菌菌群結(jié)構(gòu)與青菜原料相似，鹽漬14個(gè)月與26個(gè)月的青菜真菌菌群結(jié)構(gòu)相似，并有4條優(yōu)勢條帶。通過序列分析表明，4個(gè)優(yōu)勢條帶分別與假絲酵母屬、德巴利酵母屬、接合酵母屬的菌株相似。從鹽漬青菜樣品中分離得到10株酵母菌，通過分子生物學(xué)鑒定為漢遜德巴利酵母、釀酒酵母、魯氏接合酵母。PCR-DGGE技術(shù)對鹽漬青菜菌群結(jié)構(gòu)的解析不依賴培養(yǎng)，方便簡便快捷，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，對生產(chǎn)具有較好的指導(dǎo)作用，是一種有效的研究手段。酵母菌在發(fā)酵蔬菜中具有促進(jìn)香味物質(zhì)生成、提高發(fā)酵蔬菜品質(zhì)、抑制腐敗等功能，可進(jìn)一步開展發(fā)酵蔬菜專用酵母菌篩選、菌劑研發(fā)與應(yīng)用等研究。

致謝:本論文中的樣品采集得到了四川省吉香居食品有限公司、李記泡菜四川公司的大力支持，實(shí)驗(yàn)開展過程中宜賓學(xué)院實(shí)驗(yàn)與教學(xué)資源管理中心、固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的幫助，在此表示衷心感謝!

［1］ 張鵬.四川泡菜中酵母菌的分離篩選及其應(yīng)用研究［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［2］ 鄯晉曉.四川泡菜菌系分離、篩選及發(fā)酵劑的研究［D］. 重慶:西南大學(xué)，2008.

［3］ 曾駿，陳安均，蒲彪，等.傳統(tǒng)四川泡菜中酵母菌的動態(tài)變化規(guī)律［J］.食品科學(xué)，2014，35(7):81-85.

［4］ 羅松明，劉書亮，杜曉華，等.四川泡菜微生態(tài)分布及其與鹽度、酸度的關(guān)系.［J］食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(2):29-34.

［5］ Amann R I，Ludwig W，Schleifer K-H.Phylogenetic identification and in sutu detection of individual microbial cells without cultivation ［J］.Microbiological Reviews，1995，59(1):143-169.

［6］ Ranjardl，Ploy F，Nazaret S.Monitoring complex bacterial communities using culture-independent，molecular techniques:application to soil environment［J］.Research in Microbiology，2000，151(3):167-177.

［7］ Muyzer G，Wall E C，Uiitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA ［J］.Applied Environmental Microbiology，1993，59(3):695-700.

［8］ Ampe F，Omar N B，Moizan C，et al.Polyphasic study of the spatial distribution of microorganisms in mexican pozol，a fermented maize dough，demonstrates the need for cultivation-independent methods to investigate traditional fermentations［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(12):5 464-5 473.

［9］ Vu Nguyen Thanh，Le Thuy Mai，Duong Anh Tuan.Microbial diversity of traditional Vietnamese alcohol fermentation starters(banh men)as determined by PCR-mediated DGGE ［J］.International Journal of Food Microbiology，2008:128(2):268-273.

［10］ Ercolini D.PCR-DGGE fingerprinting:novel strategies for detection of microbes in food［J］.Journal of Microbiological Methods，2004，56(3):297-314

［11］ Omar N B，Ampe F.Microbial community dynamics during production of the Mexican fermented maize dough pozol［J］.Applied and Environmental Microbiology，2000，66(9):3 664-3 673.

［12］ 張先琴，張小平，敖曉琳，等.PCR-DGGE分析四川地區(qū)家庭制作泡菜中微生物多樣性［J］.食品科學(xué)，2013，34(12):129-134.

［13］ Chang H W，Kim K H，Nam Y D，et al.Analysis of yeasts and archaeal population dynamics in kimchi using denaturing gradient gel electrophoresis［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，126(1):159-166.

［14］ Dakal T C，Solieri L，Giudici P.Adaptive response and tolerance to sugar and salt stress in the food yeast Zygosaccharomycesrouxii［J］.International Journal of Food Microbiology，2014，185:140-157.

［15］ Wah T T，Walaisri S，Assavanig A，et al.Co-culturing of Pichia guilliermondii enhanced volatile flavor compound formation by Zygosaccharomyces rouxii in the model system of Thai soy sauce fermentation［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，160(3):282-289.

［16］ 楊松彰，崔瑞迎，何菲，等.微生物共培養(yǎng)強(qiáng)化技術(shù)對郫縣豆瓣醬陳釀過程中揮發(fā)性組分變化規(guī)律的研究［J］.中國調(diào)味品，2013，38(4):18-22.

［17］ Liliana Cano-Garcia，Monica Flores，Carmela Belloch.Molecular characterization and aromatic potential of Debaryomyces hansenii strains isolated from naturally fermented sausages［J］.Food Research International，2013，52(1):42-49.