關曉燕， 羅衛(wèi)東， 李麗麗， 董 穎*， 顧 英

（1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連116023；2.大連海洋大學 海洋與土木工程學院，遼寧 大連 116023；3.遼寧醫(yī)學院 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121000）

乳酸桿菌表層蛋白基因結構及功能研究進展

關曉燕1， 羅衛(wèi)東2， 李麗麗3， 董 穎*1， 顧 英3

（1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院，遼寧 大連116023；2.大連海洋大學 海洋與土木工程學院，遼寧 大連 116023；3.遼寧醫(yī)學院 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121000）

乳酸桿菌對宿主的黏附性是其發(fā)揮益生作用的基礎，而其黏附性與自身的表層蛋白密切相關。乳酸桿菌表層蛋白具有相對分子質(zhì)量低、高等電點、結構和基因的多樣性等特點。國內(nèi)外學者對于乳酸桿菌的表層蛋白進行了深入的研究。作者從乳酸桿菌表層蛋白的基因結構和特性、和生物學功能幾個方面對乳酸桿菌表層蛋白進行了綜述。

乳酸桿菌；表層蛋白；結構域；基因

乳酸桿菌是可以將發(fā)酵碳水化合物轉(zhuǎn)化成乳酸的一群桿狀的革蘭氏陽性細菌，在自然界分布廣泛，是動物和人腸道等處重要的生理性菌群，對于維護腸道的微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定有重要作用和意義，而與宿主胃腸道表面的粘附和定植是發(fā)揮這些作用的前提的基礎，乳酸桿菌的粘附作用和細胞的表層蛋白密切相關。表層蛋白，（S-layer protein）又稱S-層蛋白，是指存在于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和古細菌的細胞壁和細胞膜最外層的蛋白結構，在熵的驅(qū)動下，自動裝配成透明的、對稱的、多孔的類似網(wǎng)格狀的次晶格矩陣結構[1]。細菌表層蛋白相對分子質(zhì)量一般為4×104～2×105，等電點為4～6，呈酸性[2]，但乳酸桿菌的表層蛋白除外。乳酸桿菌的表層蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的最小的一類表層蛋白，相對分子質(zhì)量僅為2.5×103～7.1×103，并且該蛋白為堿性蛋白，其等電點在9.4～10.4之間[3]。

目前具有表層蛋白結構的乳酸菌都為乳酸桿菌，并不是所有乳酸桿菌都有表層蛋白，已經(jīng)證明具有表層蛋白的乳酸桿菌有短小乳酸桿菌（Lactobacillus brevis）、布氏乳酸桿菌（Lactobacillus buchneri）、瑞士乳酸桿菌（Lactobacillus helveticus）、希氏乳酸桿菌（Lactobacillus hilgardii）、嗜酸乳桿菌（L.Acidophilus）、食淀粉乳酸桿菌（Lactobacillus amylovorus）、 卷 曲 乳 酸 桿 菌 （Lactobacillus crispatus）、雞乳酸桿菌（Lactobacillus gallinarum）、解淀粉乳酸桿菌（Lactobacillus amylolyticus）、馬乳酒樣乳酸桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）、巴士乳酸桿菌（Lactobacillus pasteurii）、高加索酸奶乳酸桿菌和類高加索酸奶乳酸桿菌等。上述乳酸桿菌的全部或部分基因組中攜帶表層蛋白基因[4]。近年來，關于乳酸桿菌表層蛋白的研究集中在介導乳酸桿菌對細胞的黏附性、免疫調(diào)節(jié)、異源蛋白表達及表面展示技術等方面。作者就乳酸桿菌表層蛋白的特性、基因表達、結構、以及生物學功能等作一概述。

1 乳酸菌表層蛋白基因

目前很多的研究中，已經(jīng)對一些乳酸桿菌的表層蛋白基因進行了克隆和測序，結果顯示同一菌株存在多個表層蛋白基因是常見的現(xiàn)象，嗜酸乳桿菌具有slpA和slpB 2個基因[5]，短乳桿菌具有slpB、slpC和slpD 3個基因[6]。乳酸桿菌的多個表層蛋白基因在染色體中的排列順序具有菌株依賴性，在短乳桿菌ATCC 14869中，slpB和slpC基因是相鄰的，slpD卻相隔較遠[7]，同樣情況也出現(xiàn)在卷曲乳桿菌K313中[8]，卷曲乳桿菌K313含有slpA、slpB和slpC 3個表層蛋白基因，其中slpB和slpC相鄰排列，而slpA卻相隔較遠，正常生長條件下，slpA沉默，slpB表達量卻遠遠高于slpC基因的表達量。這也表明同一菌株中多個表層蛋白基因不能同時表達。目前只有短乳桿菌ATCC14869的slpB和slpD[7]，卷曲乳桿菌K313的slpB和slpC基因，嗜酸乳桿菌的NCFM的slpA和slpA的基因敲除突變體slpX（或者是slpB和slpX）能同時表達[9-10]。

乳酸桿菌表層蛋白是菌體中含量較高的蛋白質(zhì)，占菌體總蛋白質(zhì)的10%～15%，說明該蛋白基因表達量比較高。乳酸菌表層蛋白基因的高效率表達與其多重啟動子結構有關，在短小乳酸桿菌ATCC8287的slpA、短乳桿菌ATCC14869的slpB和嗜酸乳酸桿菌ATCC4356的slpA基因的上游區(qū)存兩個啟動子[11]。這些啟動子具有較高的活性，起到增強和調(diào)節(jié)基因表達的作用。乳酸桿菌表層蛋白基因的mRNA分子的半衰期較長，短小乳酸桿菌ATCC8287和嗜酸乳酸桿菌ATCC4356的表層蛋白轉(zhuǎn)錄基因的半衰期分別為14 min和15 min[12-13]，而一般原核生物的mRNA的半衰期為2～3 min[14]。乳酸桿菌表層蛋白的mRNA分子5’端長的不可翻譯區(qū)形成了一個穩(wěn)定的二級結構，可保護mRNA分子降解，從而促進了高效表達。此外，表層蛋白高效表達還與信號肽引導的高輸出率、密碼子的偏好性等有關[15]。

乳酸桿菌的表層蛋白基因表達與菌株所在的生態(tài)環(huán)境有關，短乳桿菌ATCC 14869的slpD的表達與培養(yǎng)基中含氧量及成長階段有關[7]，在氧氣充足培養(yǎng)基和指數(shù)增長期才表達?，F(xiàn)在分子水平上，關于乳酸菌表層蛋白的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制探索較少。

2 乳酸桿菌表層蛋白結構和特性

乳酸桿菌表層蛋白是由相同的蛋白或糖蛋白亞基構成[16]。許多革蘭氏陽性菌中表層蛋白具有糖蛋白亞基，在乳酸桿菌的表層蛋白中卻少見。以前只有布氏乳酸桿菌中表層蛋白中發(fā)現(xiàn)糖蛋白[17]，近年來在高加索酸奶乳酸桿菌和瑞士乳酸桿菌中發(fā)現(xiàn)了糖基化的表層蛋白[18-19]。乳酸桿菌表層蛋白亞基的氨基酸組成相近，疏水性氨基酸和堿性氨酸占主體，含硫氨基酸的含量較低，因此，乳酸桿菌表層蛋白呈堿性，且其中帶正電荷的氨基酸含量高于帶負電荷的氨基酸含量，這使得乳酸桿菌表層蛋白的等電點較高，分布在9.4～10.4之間，成為乳酸桿菌表層蛋白獨有的特性[20-21]。

盡管不同乳酸桿菌表層蛋白的氨基酸組成相似，但其在結構上具有多樣性。乳酸桿菌表層蛋白的一級結構相似性極低，即氨基酸排列順序存在較大差異。不同乳酸桿菌表層蛋白的氨基酸排列順序不同，甚至同種乳酸桿菌的不同菌株的表層蛋白的氨基酸排列順序也不相同，這有利于不同乳酸桿菌共存于同一環(huán)境。通過圓二色譜分析乳酸桿菌的二級結構得出乳酸桿菌表層蛋白的20%的氨基酸構成α-螺旋、40%的構成β-折疊片、5%-54%構成無規(guī)則卷曲[22]。高加索酸奶乳酸桿菌和短乳酸桿菌的表層蛋白中α-螺旋含量為0～21%，β-折疊片為23%～50%，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量為37%～63%[23]。但Verbelen等[24]用原子力顯微鏡觀察卷曲乳桿菌的表層蛋白CbsA及其C-末端和N-末端片段，發(fā)現(xiàn)在CbsA的N-末端至少有4個大小不一的α-螺旋結構卻不具有β-折疊片。這表明乳酸桿菌的表層蛋白的二級結構也具有多樣性。乳酸桿菌表層蛋白的相對分子質(zhì)量較小，在溶液易形成二維的晶格而不是三維的晶體。因此，目前原子分辨率水平上的乳酸菌桿表層蛋白的三級結構尚不可用[16]。

3 乳酸桿菌表層蛋白的結構域

乳酸桿菌的表層蛋白具有細胞壁連接結構域和自我組裝結構域。乳酸桿菌表層蛋白的細胞壁連接結構域與表層蛋白連接在乳酸桿菌細胞壁表面的糖鏈結合的肽段有關，其連接作用與一個特殊的細胞壁多聚體亞單位有關。在嗜酸乳酸桿菌家族中，表層蛋白的細胞壁連接結構域為表層蛋白C-末端保守區(qū)域，該區(qū)域等電點高、富含攜帶正電荷的賴氨酸，通過靜電作用與細胞壁中帶負電荷的磷壁酸結合[25]。而在短乳酸桿菌ATCC 8287中，表層蛋白的N-末端卻相對保守，等電點高，與細胞壁上的多糖通過氫鍵相連[26]。

通過電鏡觀察乳酸桿菌的表層蛋白結構發(fā)現(xiàn)，表層蛋白的自我組裝區(qū)域位于表層蛋白的中心或N-末端[27]。嗜酸乳桿菌的SA蛋白和卷曲乳桿菌的CbsA蛋白的N-末端的高度可變區(qū)域負責表層蛋白單體自我組裝成規(guī)則晶格結構[28-29]。SA蛋白的自我組裝結構域是由12 000和18 000的兩個子域通過一個表面暴露的環(huán)相連構成的，其保守區(qū)域和可預測區(qū)域形成的二級結構是形成規(guī)則晶格結構的關鍵[30]。CbsA自我組裝結構域中富含纈氨酸側(cè)鏈對表層蛋白形成特定晶格結構非常重要，可能指導特定聚合物的形成[31]。無論在體內(nèi)還是體外，乳酸桿菌表層蛋白都可自我組裝成規(guī)則的晶格結構，為納米材料開發(fā)提供新的選擇。

4 乳酸桿菌表層蛋白的生物學功能及應用

4.1 粘附作用

乳酸桿菌表層蛋白與乳酸桿菌黏附性有關，是乳酸桿菌粘附不同宿主的中介物。在致病菌中，表層蛋白通過粘附、抗原變異和共聚等多種機制產(chǎn)生致病性，但乳酸桿菌是益生菌，表層蛋白是其益生作用因子，介導乳酸桿菌與胃腸道等組織的黏附力，抑制大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌對腸道粘附。卷曲乳酸桿菌JCM 5810對雞腸道的膠原蛋白具有粘附作用，在體外，該菌株也可對雞腸道的膠原蛋白進行粘附。而用鹽酸胍去除卷曲乳酸桿菌JCM 5810細胞外的表層蛋白，無有表層蛋白的卷曲乳酸桿菌JCM 5810細胞卻對雞腸道的膠原蛋白無粘附作用。這說明卷曲乳酸桿菌JCM 5810的黏附性與其表層蛋白密切相關[32]。張英春等[33]研究發(fā)現(xiàn)副干酪乳酸桿菌M5-1的表層蛋白參與了該菌株抑制宋內(nèi)志賀氏菌對HT-29細胞的粘附，并且副干酪乳酸桿菌M5-1的表層蛋白也能抑制宋內(nèi)志賀氏菌對HT-29細胞的粘附。并不是所有的乳酸桿菌的表層蛋白都與粘附性有關，嗜酸乳桿菌BG2FO4的表層蛋白不參與乳酸桿菌的粘附和對致病菌的粘附性[34]。這說明乳酸桿菌的表層蛋白在功能上也存在多樣性。

4.2 異源蛋白質(zhì)的表達載體或分泌性表達載體

乳酸桿菌表層蛋白基因具有多重啟動子結構，并且所乳酸桿菌的表層蛋白N-末端都有由25-30個氨基酸組成的信號肽[35]，因此表層蛋白質(zhì)的功能主要集中在利用其啟動子或信號肽序列生產(chǎn)胞內(nèi)或胞外異源蛋白質(zhì)。應用比較廣泛的是短小乳酸桿菌slpA基因的啟動子和信號肽。短小乳酸桿菌的slpA基因的啟動子用于葡萄糖苷酸酶在乳球菌中高效表達[36]。利用短小乳酸桿菌ATCC8287的表層蛋白SlpA的信號肽使β-內(nèi)酰胺酶在乳球菌中分泌表達，其分泌量高達到80 mg/L[37]。但乳酸桿菌表層蛋白基因表達系統(tǒng)具有宿主選擇性。嗜酸乳酸桿菌ATCC4356的表層蛋白的啟動子在干酪乳酸桿菌的轉(zhuǎn)錄活性較高但在瑞特乳酸桿菌中的轉(zhuǎn)錄效率則較低[28-38]。這說明表層蛋白基因表達分泌系統(tǒng)也存在多樣性，并且表達效率與宿主有關。

4.3 免疫調(diào)節(jié)作用

目前關于乳酸桿菌的表層蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用主要為誘導免疫應答和作為抗原疫苗載體。通過基因敲除技術研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌NCFM的SlpA蛋白能與人的未成熟的樹突狀細胞的特異要性抗原受體結合，誘導IL-10的生成，并抑制IL-12、p70的表達參與免疫應答，起到免疫調(diào)節(jié)作用[39]。乳酸桿菌表層蛋白是異源蛋白的高效表達載體和分泌表達載體。因此，乳酸桿菌表層蛋白可作為外源抗原的運輸載體，通過基因工程技術將抗原蛋白表達于細胞表面，主要應用于口服抗原疫苗開發(fā)。乳酸桿菌能在胃腸道定植，因此乳酸桿菌的表層蛋白具有耐膽汁、耐胃酸等特點。這能很好地克服口服抗原被膽汁、胃酸和胃蛋白酶降解的缺點，有利于口服抗原簡便、安全、高效地通過胃腸道，從而發(fā)揮免疫功能。特別是能夠攜帶由混合蛋白組成的表層蛋白的乳酸桿菌菌株具有作為活的黏膜疫苗的潛力。利用短小乳酸桿菌KCTC3102和ATCC8287的表層蛋白與上皮細胞結合特性，將純的免疫球蛋白結合融合蛋白與小牛腸道表面的靶向抗體結合，可以防止新生牛犢腹瀉[40]。

5 展望

人們已經(jīng)利用生物、物理、化學以及計算機模型方法對乳酸菌表層蛋白的結構、基因表達機制和應用進行分析，發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌表層蛋白具有多重啟動子和信號肽的的特點，是異源蛋白表達和展示載體，也是抗原疫苗良好的運輸載體。并且乳酸桿菌的表層蛋白乳酸桿菌的粘附性密切相關，可作為粘附素?，F(xiàn)在雖對乳酸桿菌表層蛋白有一定的了解，但還有很多作用機制及機理尚待研究。如乳酸桿菌表層蛋白是否只是通過粘附和競爭抑制方式來抑制病原菌，以便全面了解并開發(fā)乳酸桿菌表層蛋白的潛能。

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Review on Genes Structures and Functions of Surface Layer Proteins from Lactobacillus spp.

GUAN Xiaoyan1， LUO Weidong2， LI Lili3， DONG Ying*1， GU Ying3
（1.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian 116023，China；2.Ocean and Civil Engineering Institute，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；3.Food Science and Engineering Institute，Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

The adhesion of Lactobacillus to the host is a basis of its probiotic functions and depends on surface layer proteins.These proteins from Lactobacillus have low molecular weights，high isoelectric points，various structures and genes and other characteristics，which are different from other surface layer proteins.Herein we summarize structures，genes and biological functions of surface layer proteins from Lactobacillus.

Lactobacillus，surface layer proteins，structural region，gene

TQ 93

A

1673—1689（2015）07—0679—06

2014-06-21

遼寧省海洋與漁業(yè)廳科研項目（201301）；海洋公益項目（201305001）；遼寧省科技計劃項目（2013203001）。

關曉燕（1983—），女，遼寧營口人，工學博士，助理研究員，主要從事海洋微生物研究。E-mail：guanxiaoyan201@163.com

*通信作者：董 穎（1971—），女，遼寧大連人，副研究員，主要從事海水養(yǎng)殖研究。E-mail：ebuma@sina.com