張亦鳴，謝晶，薛斌，周冬香，邵則淮，胡月華，孫濤

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工儲藏工程研究中心，上海，201306)

木糖是一種廣泛存在于自然界的植物纖維素，由木糖分子以β-1，4糖苷鍵連接而成［1］。它具有低熱量、改善人體的微生物環(huán)境，提高機體免疫力的功效［2-5］。作為木糖的寡聚糖，低聚木糖(xylo-oligosaccharide，XO)由 2 ～7 個木糖分子結(jié)合而成［6］，它可增加腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量，對巨噬細胞、淋巴細胞有吞噬能力，可直接殺傷腫瘤細胞，增強機體免疫能力［7-9］。此外，低聚木糖可顯著降低血壓、血清膽固醇，并有效控制血糖水平，具有非常高的醫(yī)療保健價值。

化學(xué)改性是賦予多糖活性的重要手段［10-11］，但往往會引入雜質(zhì)和副產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)是伴隨著食品加工、生產(chǎn)、貯藏過程中常見的反應(yīng)，是一種安全可靠的多糖改性手段［12-13］。

作為潛在的食品保鮮劑，木糖-殼聚糖美拉德共聚物［3］具有良好的抗菌性、抗氧化性;木糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物［4］具有很好的Fe2+螯合能力，可降低油脂過氧化值(POV);在半干面中添加0.35%木糖-殼聚糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物［5］，其貨架期可延長7 d。具有上述活性的為木糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其中包含小分子醛酮類等易揮發(fā)物質(zhì)，而以美拉德反應(yīng)為改性手段，對其衍生物的活性與結(jié)構(gòu)關(guān)系研究還較為罕見。

本文以美拉德反應(yīng)為改性手段，制備低聚木糖美拉德衍生物，考察其抗氧化能力，為低聚木糖化學(xué)改性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

低聚木糖(≥95%)，生化級，購自上海金穗生物科技有限公司;魯米諾、DPPH，Sigma公司;其余試劑均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司?？寡趸瘻y試所需溶液，由二次蒸餾水配制。

WFZ UV2000型紫外分光光度計(上海合利儀器有限公司);島津RF-530 PC熒光分光光度計(日本島津公司);Delta 320型 pH計(梅特勒-托利多儀分析儀器上海有限公司);FTIR-650傅立葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發(fā)展股份有限公司);IFFM-D型流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀(西安瑞邁科技有限公司);METTLER AE200型電子分析天平;JI80-2B型臺式離心機。

1.2 低聚木糖美拉德反應(yīng)衍生物的制備

稱取低聚木糖10.0 g，加入7.7 g脯氨酸，使得羰基和氨基的摩爾質(zhì)量比為1∶1，用100 mL的二次蒸餾水溶解，在100℃條件下冷凝回流反應(yīng)。監(jiān)測反應(yīng)過程中pH、吸光度以及熒光值的變化，并用丙酮分離提取5、15和30 h低聚木糖美拉德衍生物，記為XP-5h、XP-15h 和 XP-30h。

1.3 測試表征

紅外光譜在FTIR-650傅立葉變換紅外光譜儀上進行，采用KBr壓片法制樣，測定波數(shù)范圍為500～4 000 cm-1，分辨率為 4 cm-1。

產(chǎn)物的相對平均分子質(zhì)量及其分布采用GPC法測定。GPC測試條件如下:流動相:0.2 mmol/L醋酸鈉和醋酸緩沖溶液，pH4.80;監(jiān)測器:Waters 2410示差折光監(jiān)測器;柱子:TOSOH BIOSEP TSKGelG4000SWXL:溫度:40℃;標準物質(zhì)為:葡聚糖，(分子質(zhì)量:473 000、188 000、76 900、43 200、10 500、4 440 Da)。

1.4 抗氧化性能測定

1.4.1 對DPPH自由基(DPPH·)的清除作用［14］

在裝有2.0 mL的濃度為1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液的比色管中，加入不同濃度的樣品溶液2.0 mL，搖勻，33℃避光靜置0.5 h，在517 nm處測量吸光度Ai。用去離子水代替樣品溶液，得吸光度A0，無水乙醇代替DPPH，得吸光度Aj。

清除率/%=(1-(Ai-Aj)/A0)×100

1.4.2 對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用［15］

1.5×10-3mol/L的魯米諾溶液用0.05 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液(pH10.20)配制，0.1 mol/L的鄰苯三酚儲備液用1×10-3mol/L的HCl配制，使用前用去離子水稀釋至1×10-4mol/L。使用緩沖液作為溶劑，配制不同濃度的樣品溶液。采用流動注射化學(xué)發(fā)光分析儀來測定樣品溶液的峰面積，具體如下:蠕動泵分別泵入魯米諾、緩沖溶液以及鄰苯三酚，在流通池中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，記錄發(fā)光信號強度，以峰面積定量。經(jīng)SOD、過氧化氫酶以及甘露醇檢測，該體系產(chǎn)生的自由基為超氧陰離子O2-·。

式中:A0為空白溶液峰面積;Ai為樣品溶液峰面積。

1.4.3 還原能力的測定［16］

取2.0 mL不同濃度的樣品，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.60)和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻，50℃水浴20 min后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻后在3 000 r/min下離心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液，靜置10min后在700 nm處測定吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有實驗重復(fù)3次，最終數(shù)據(jù)為3次實驗數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值。兩組間比較采用t檢驗(P＜0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值的變化

低聚木糖與脯氨酸美拉德反應(yīng)過程中的pH變化如圖1所示。反應(yīng)體系的初始pH呈弱酸性，隨著反應(yīng)的推進，反應(yīng)物pH逐漸降低，說明反應(yīng)中生成羥甲基糠醛等酸性物質(zhì)，這與文獻中的結(jié)論一致［17］。

2.2 UV-Vis吸光度的變化

美拉德反應(yīng)中期，會生成無色小分子中間體，如:Amadori重排產(chǎn)物裂解的丙酮醛、丁二酮、丙酮醇等，以及它們在Strecker降解后生成的小分子醛類，這些中間體在295 nm處有紫外吸收;其后反應(yīng)物經(jīng)過環(huán)化、降解、縮合等，形成褐色產(chǎn)物，在420 nm處有可見光吸收［18］。紫外-可見吸收值越高，美拉德反應(yīng)就越充分，由此可衡量反應(yīng)的進程。圖2為低聚木糖與脯氨酸美拉德反應(yīng)過程中紫外-可見吸光度的變化。由圖可知，隨著反應(yīng)時間延長，295 nm處紫外吸收增加，說明反應(yīng)中生成了越來越多的小分子醛類物質(zhì);在440 nm處的可見光吸收值也在增加，反應(yīng)物褐色程度加深。

2.3 熒光值的變化

由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，如:羧甲基賴氨酸、戊糖苷素、精氨嘧啶等，具有自發(fā)熒光的特性，當(dāng)受到300～420 nm的入射光激發(fā)后，在420～600 nm會產(chǎn)生熒光光譜［19］，化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，其熒光光譜特征不同。圖3為低聚木糖與脯氨酸美拉德反應(yīng)過程中，在激發(fā)波長為370 nm、發(fā)射波長為440 nm處熒光值的變化。由圖可知，隨著反應(yīng)推進，熒光值增加，說明反應(yīng)中生成了越來越多的熒光物質(zhì)。

2.4 低聚木糖美拉德產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

圖4為低聚木糖、脯氨酸及其美拉德反應(yīng)衍生物的紅外譜圖。低聚木糖在3 413 cm-1處的吸收峰是-OH的伸縮振動吸收峰，2 923 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動吸收峰，1 636 cm-1處的吸收峰是-OH的彎曲振動吸收峰，而在1 032 cm-1處的吸收峰，則是醇羥基的變角振動吸收峰，在892 cm-1處存在型糖苷鍵的特征吸收峰，與文獻相符［2］;脯氨酸在3 433 cm-1處的吸收峰是水分子-OH的伸縮振動吸收峰，3 062 cm-1處的吸收峰為-NH2+的N-H伸縮振動峰，1 623 cm-1為羧基中C-O雙鍵的伸縮振動峰，而1 380 cm-1處為羧基中C-OH中C-O單鍵的伸縮振動。美拉德反應(yīng)后的衍生物c，d，e保留了低聚木糖2 923 cm-1處C-H的伸縮振動吸收峰，1 032 cm-1處醇羥基的變角振動吸收峰，以及892 cm-1附近的多糖特征吸收帶;而脯氨酸3 062 cm-1處的-NH2+的N-H伸縮振動峰消失，說明反應(yīng)部位在此處;衍生物保留了脯氨酸的1 623 cm-1峰和1 380 cm-1峰，說明衍生物中含有羧基。

GPC法測得低聚木糖的相對分子質(zhì)量為3 879，低聚木糖衍生物XP-5h、XP-15h和XP-30h的相對分子質(zhì)量為3 925、4 044和4 071，衍生物的相對分子質(zhì)量都有所增加，且隨著反應(yīng)時間增加，分子質(zhì)量逐漸增大，表明低聚木糖分子中的羰基與脯氨酸的游離氨基反應(yīng)，生成了更大的分子。

2.5 對DPPH·的清除

DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，廣泛用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力［20］。DPPH·在乙醇溶液中呈深紫色，在517 nm處有最大吸收峰，當(dāng)有自由基清除劑存在時，其單電子被結(jié)合而使其顏色減褪，在最大吸收波長處的吸光度減小，減小的程度與清除劑的清除能力及其數(shù)量呈定量關(guān)系。圖5描述了低聚木糖衍生物對DPPH·的清除能力。由圖5可知，XP-30h，XP-15h和XP-5h的IC50(對自由基清除率為50%時所需要的自由基清除劑濃度)分別為0.046、0.080和0.085 mg/mL，衍生物對DPPH·的清除能力強弱順序為XP-30h＞XP-15h＞XP-5h，即隨著反應(yīng)進行，低聚木糖美拉德反應(yīng)衍生物對DPPH·的清除能力逐漸增強。茶多酚TP對照組對DPPH·的清除能力遠遠高于低聚木糖衍生物，濃度大于0.005 mg/mL茶多酚對DPPH·的清除能力幾乎為100%。由于低聚木糖XO幾乎對DPPH·無清除能力，而美拉德反應(yīng)后的低聚木糖衍生物對DPPH·的清除能力顯著提升，說明美拉德反應(yīng)是賦予低聚木糖強抗氧化性的有效手段，這可能與美拉德反應(yīng)過程中生成羰基類物質(zhì)有關(guān)，相關(guān)機理有待進一步研究。

2.6 對O2-·的清除

O2-·是一類較毒的活性氧自由基，由多種生物反應(yīng)和光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生，它還能分解形成更強的活性氧物質(zhì)，如單線態(tài)氧和羥自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化［21］。圖6描述了低聚木糖衍生物清除O2-·的能力，XP-30h、XP-15h、XP-5h對 O2-·半抑制濃度 IC50分別為0.581、0.618和1.199 mg/mL，即對 O2-·清除能力為:XP-30h＞XP-15h＞XP-5h，略低于茶多酚TP對照組(IC50為0.387m g/mL)，而遠遠高于低聚木糖(IC50為4.260 mg/mL)，這與上述DPPH·清除實驗結(jié)果一致。

2.7 還原能力的測定

還原能力是表示抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標，研究表明抗氧化活性和還原能力之間存在著密切的關(guān)系［22］。如圖7所示，在濃度為0.5 mg/mL時，XP-30h、XP-15h和XP-5h的吸光度分別為1.205、1.198和0.994，還原能力強弱順序為XP-30h≈XP-15h＞XP-5h;對照組茶多酚TP在濃度為0.5 mg/mL時的吸光度為1.496，高于低聚木糖衍生物。而低聚木糖幾乎無還原能力，說明美拉德反應(yīng)后的衍生物還原能力得到顯著提升，這與上述DPPH清除實驗和O2-·清除實驗結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本實驗以美拉德反應(yīng)為改性手段，制備低聚木糖衍生物，并考察其對DPPH·和O-2·的清除能力，以及還原能力。結(jié)果表明，低聚木糖衍生物的抗氧化性均大大提升，故可以認為美拉德反應(yīng)是低聚木糖改性的有效手段，且隨著美拉德反應(yīng)的進行，衍生物的抗氧化性越來越強，但相關(guān)機理還待進一步研究。本研究為運用天然多糖制備安全、高效的抗氧化劑提供了很好的思路。

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