彭國麗,呂 治,蘇建榮

(首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院檢驗科,北京100050)

乳酸桿菌(Lactobacillus)是健康女性陰道正常菌群中的優(yōu)勢菌,在維持陰道自凈及拮抗病原微生物感染中起著重要作用。不同人群,由于年齡、種族、地域、生活習慣的不同,陰道乳酸桿菌的種類和數(shù)量存在著差異;即使同一健康人群在不同季節(jié)、生理條件下,陰道乳酸桿菌的構成也會發(fā)生變化。國外研究顯示,陰道中分離的主要乳酸桿菌有卷曲乳酸桿菌(L.crispatus)、詹氏乳酸桿菌(L.jensenii)、嗜酸乳酸桿菌(L.acidophilus)、惰性乳酸桿菌(L.iners),加氏乳酸桿菌(L.gasseri)等,不同國家或地區(qū)的報道存在較大差異,在國內(nèi)尚缺乏這方面的研究數(shù)據(jù)。

本研究采用針對不同分類單元的乳酸桿菌16SrRNA基因特異性引物結合SYBRGreen I熒光定量PCR,對中國北方春夏季節(jié)和秋冬季節(jié)采集的97例健康育齡婦女陰道分泌物標本中的5種乳酸桿菌進行定量和定性檢測。確定陰道乳酸桿菌的種類及數(shù)量,并比較不同季節(jié),陰道乳酸桿菌分離率和數(shù)量的差異。

1 材料與方法

1.1 試劑

硅膠膜型基因組DNA提純試劑盒,北京賽百盛基因技術有限公司產(chǎn)品。PCR Taq Mix,廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品。SYBR Green I Premix Ex TaqⅡ熒光定量檢測試劑盒(DRR081A),pMD19-T Simple Vector(D104A)TA克隆載體,E.coli DH5a感受態(tài)細胞(D9057),大連寶生物公司產(chǎn)品。Ampicillin(氨芐青霉素)、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、X-Gal(5-溴-4氯-3-吲哚半乳糖苷),北京賽百盛基因技術有限公司產(chǎn)品。AxyPerp質(zhì)粒 DNA小量試劑盒,AxyPerp PCR清潔試劑盒,愛思進生物技術有限公司產(chǎn)品。ATCC標準菌株 :卷曲乳酸桿菌L.crispatusATCC 33820、詹氏乳酸桿菌 L.jensenii ATCC 25258、加氏乳酸桿菌 L.gasseri ATCC 33323、嗜酸乳酸桿菌L.acidophilus ATCC 4356,內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室惠贈。LB、SOC、MRS、ROGSA 培養(yǎng)基,LB/Amp/X-Gal/LPTG 平板培養(yǎng)基,參照說明書自行配制。

1.2 儀器

ABI 7300型實時熒光定量PCR分析儀,DYY-10C型電泳儀,BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 研究對象 分別于2008年12月-2009年2月(秋冬季節(jié))、2009年6月-8月(春夏季節(jié))在北京友誼醫(yī)院體檢的健康育齡期婦女97例(春夏季63例,秋冬季34例)。年齡18-45歲,除外淋病、梅毒等性傳播疾病和細菌性、真菌性、滴蟲性陰道疾病。

1.3.2 標本采集 月經(jīng)結束后2-4天,用無菌棉拭子在陰道壁下1/3處旋轉(zhuǎn)數(shù)次,停留30 s至拭子飽和,每根拭子飽和的分泌物體積為0.2 ml,置于無菌試管中立即送檢。

1.3.3 細菌基因組DNA提取 陰道拭子在1.8 ml PBS緩沖液中振蕩混勻,13 000轉(zhuǎn)離心10分鐘,棄上清,收集菌體。按照基因組DNA提純試劑盒說明書提取細菌基因組DNA,-70℃冷凍保存。

1.3.4 引物合成 根據(jù)參考文獻[1-4]合成乳酸桿菌屬、卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、惰性乳酸桿菌16SrRNA基因特異性引物。

1.3.5 16SrRNA基因常規(guī)PCR檢測 25 μ l反應體系 ,引物各 1 μ l(10 μ mol/L)、dNTPs 200 μ mol/L 、MgCl21.5 mmol/L、KCl 50 mmol/L、Tris-HCl 10 mmol/L、TaqDNA聚合酶1U、模板 2 μ l,超純水補足體積。5種乳酸桿菌特異性引物、PCR反應條件及擴增產(chǎn)物片段大小見表1。

表1 乳酸桿菌特異性16SrRNA基因引物序列、反應條件、產(chǎn)物片段

1.3.6 熒光定量PCR標準品制備 將乳酸桿菌ATCC標準菌株在MRS、ROGSA培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。挑取單個菌落,提取細菌基因組DNA進行常規(guī)PCR擴增,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性產(chǎn)物切膠純化回收,與pMD19-T Simple Vector載體進行連接反應,具體步驟按照試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細胞,在X-gal/ITPG培養(yǎng)基上進行藍白斑篩選。挑取帶有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的白色菌落在SOC液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取重組質(zhì)粒測序鑒定,紫外分光光度計測定核酸濃度,確定拷貝數(shù),連續(xù)10倍稀釋后檢測得到的CT值與樣品濃度繪制熒光定量PCR標準曲線。

1.3.7 SYBR Green I Real-Time PCR進行細菌定量分析,通過熔解曲線分析,檢測非特異性產(chǎn)物并對引物濃度進行優(yōu)化,確定擴增產(chǎn)物的Tm。

1.3.8 產(chǎn)物分析 擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠(含

0.15 μ g/ml溴化乙啶)100 V 電壓電泳30-40 min,全自動凝膠成像系統(tǒng)顯像觀察。符合片段大小的PCR陽性產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后由金唯智生物科技有限公司進行測序。結果通過BLAST與Gene Bank比對驗證(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。

1.3.9 統(tǒng)計分析 用SPSS11.5進行統(tǒng)計學分析,兩組標本乳酸桿菌分離率比較用χ2檢驗,乳酸桿菌數(shù)量比較用t檢驗。

2 結果

2.1 常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳見圖1,陰道5種乳酸桿菌不同季節(jié)分離率及數(shù)量比較見表2。

2.2 健康育齡婦女陰道分泌物標本中乳酸桿菌分離率為96.9%(94/97),其中卷曲乳酸桿菌分離率最高為66.0%(64/97),其次為惰性乳酸桿菌45.4%(44/97),嗜酸乳酸桿菌40.2%(39/97),詹氏乳酸桿菌36.1%(35/97)、加氏乳酸桿菌12.4%(12/97)。

2.3 陰道分泌物標本中乳酸桿菌16SrRNA基因拷貝數(shù)104-1010copies/ml,平均值 6.21±1.28(log10copies/ml)。5種乳酸桿菌中,卷曲乳酸桿菌最多為5.09±2.98(log10copies/ml)占絕對優(yōu)勢,惰性乳酸桿菌數(shù)量僅次于卷曲乳酸桿菌為 3.90±1.52(log10copies/ml),兩者共同構成陰道主要優(yōu)勢菌。詹氏乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌均可在標本中檢出,但數(shù)量上不占優(yōu)勢。陰道中的乳酸桿菌多為1-3種(76/97,78.3%),以卷曲乳酸桿菌的數(shù)量占絕對優(yōu)勢。

圖1 PCR產(chǎn)物2.0%瓊脂糖凝膠電泳

表2 不同季節(jié)健康婦女陰道乳酸桿菌分離率和數(shù)量比較(Log10copies/ml±SD)

2.4 春夏季與秋冬季比較,5種陰道乳酸桿菌分離率在不同季節(jié)無明顯差異(P＞0.05)。在數(shù)量上,秋冬季節(jié)婦女陰道中卷曲乳酸桿菌數(shù)量(3.62±2.75)明顯低于春夏季(5.24±3.07,P＜0.05)。其他4種乳酸桿菌在不同季節(jié)的數(shù)量無統(tǒng)計學差異。

3 討論

本研究顯示健康育齡期婦女陰道乳酸桿菌分離率占96.9%,卷曲乳酸桿菌和惰性乳酸桿菌是中國婦女陰道主要乳酸桿菌,該結果與張彥采用文庫構建方法和韓國Hyeran Nam采用溫度梯度凝膠電泳方法所得的婦女陰道主要乳酸桿菌構成結果相似,而與美國學者的研究存在差異[5-7]。提示人體陰道菌群的微生物構成存在地域上的差異。健康婦女陰道中一般為1-2種乳酸桿菌,且以一種占絕對優(yōu)勢。

國外研究顯示,不同季節(jié)人體微生態(tài)環(huán)境中的細菌構成及數(shù)量會發(fā)生改變,春夏季與秋冬比較,某些細菌的數(shù)量明顯增多[5,8,9]。本研究檢測的5種陰道乳酸桿菌分離率在不同季節(jié)無顯著性差異(P＞0.05)。說明環(huán)境氣候因素不能對人體的陰道乳酸桿菌構成產(chǎn)生決定性影響。然而,本研究中的卷曲乳酸桿菌數(shù)量在春夏季節(jié)明顯多于秋冬季節(jié)(P＜0.05),是唯一在不同氣候條件下數(shù)量發(fā)生明顯改變的陰道乳酸桿菌,其他4種乳酸桿菌數(shù)量在不同季節(jié)無顯著性差異(P＞0.05)。卷曲乳酸桿菌是產(chǎn)過氧化氫能力最強的乳酸桿菌之一,在維持陰道自凈及拮抗病原微生物感染中起著重要作用。陰道卷曲乳酸桿菌數(shù)量季節(jié)性發(fā)生顯著性變化提示我們,該菌是一種對人體微環(huán)境變化非?！懊舾小钡募毦?由于其在陰道防御機制中的重要作用,必然會對陰道中的其他細菌產(chǎn)生影響。因此,研究產(chǎn)生這種變化的原因?qū)τ谖覀冋J識陰道益生乳酸菌與陰道細菌性疾病發(fā)病機理具有重要意義。

本研究采用熒光定量PCR結合16SrRNA基因、TA克隆技術比較不同季節(jié)育齡婦女陰道分泌物中5種主要乳酸桿菌的構成和數(shù)量變化。傳統(tǒng)細菌分離培養(yǎng)技術在標本采集、運送、接種上均有較嚴格的要求。而提取細菌基因組DNA可以長期保存,集中檢測,PCR方法即可檢測活的可培養(yǎng)細菌,也可檢測無法培養(yǎng)的細菌,在對未知的病原菌的檢測上也具有廣泛的應用前景。細菌16SrRNA基因,存在于所有細菌及衣原體等原核生物的染色體基因中,其特點是多拷貝、多信息、長度適中,是細菌鑒別、分類的金標準。分子生物學技術的綜合應用為研究復雜的人體微生物環(huán)境提供了有力的工具,也為分子診斷學的應用開辟了廣闊的前景。

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