萬紅貴，鄧春亞，譚海濤，龔寅聰

1(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，210009)

2(南京工業(yè)大學國家生化中心，江蘇南京，211816)

三肽物γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸或稱谷胱甘肽(GSH)，是細胞內(nèi)合成的最重要的低分子量抗氧化劑。谷胱甘肽在許多生命活動中起著直接或間接的作用，這些作用包括自然抗氧化劑、對細胞的保護、氨基酸轉(zhuǎn)運、免疫功能調(diào)節(jié)、促進糖類、脂肪及蛋白質(zhì)代謝等作用［1］，也能影響細胞的代謝過程，大量應(yīng)用于醫(yī)藥保健、護膚美容、食品添加等行業(yè)［2-3］，近年來谷胱甘肽廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤、HIV、急性中毒、化療、肝損傷、腎病綜合征等多種疾病輔助治療［4-6］。

目前，谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要以酶法和發(fā)酵法為主，與發(fā)酵條件和工藝流程的優(yōu)化相關(guān)的研究尤為突出。前體氨基酸的添加［7］、表面活性劑的使用［8］、乙醇濃度的控制［9］、葡萄糖的流加等方案的設(shè)計大大提高了發(fā)酵法產(chǎn)谷胱甘肽的效率。但是絕大部分的發(fā)酵法產(chǎn)谷胱甘肽采用的都是常規(guī)菌種進行正常發(fā)酵，耗時耗力，不宜進行工業(yè)化。本文選取廢酵母為研究對象，由于縮短了發(fā)酵耗時并降低了生產(chǎn)成本，谷胱甘肽的生產(chǎn)效率得到顯著地提升。此外，對發(fā)酵過程中的菌體實施外援刺激以加速谷胱甘肽的合成的相關(guān)報道也并不多見。本文就氧化刺激和高滲刺激2個方面探討了這2類刺激物對啤酒廢酵母發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘肽的影響。

1 材料和方法

1.1 菌種

啤酒廢酵母:南京金陵啤酒廠提供。

1.2 培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖 25，蛋白胨 10，KH2PO41，K2HPO41，Mg-SO42.5，CaCl20.3，F(xiàn)eSO40.05，pH 5.5。

1.3 培養(yǎng)方法

按10 g/100 mL的接種量將抽濾得到的濕酵母接入用無菌水配制的上述培養(yǎng)基中，裝液量40 mL/500 mL，30℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)4 h后，加入少量前體氨基酸。

1.4 樣品的處理

取一定體積的發(fā)酵液，5 500 r/mmin離心8 min，上清液用于殘?zhí)堑臏y定，菌體用蒸餾水洗滌2次，加入40%的乙醇溶液30℃萃取2 h。5 500 r/min離心，萃取液適當稀釋后作為谷胱甘肽的測定樣品，離心獲得的酵母菌體105℃烘干至恒重測生物量。

1.5 分析方法

殘?zhí)堑臏y定:DNS法測定殘?zhí)菨舛龋?0］。

谷胱甘肽含量的測定:DTNB 法［11］、ALLOXAN法［12］。

生物量:將離心獲得的酵母菌體105℃烘干至恒重，稱得干菌體的質(zhì)量，作為菌體生長情況的量化指標。

谷胱甘肽合成酶系酶活［13］:將離心收集后的濕菌體1 g用磷酸緩沖液5 mL懸浮，超聲波90 kHz破碎8 min，加入10 mL酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)液(谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸各 20 mmol/L，MgSO425 mmol/L，ATP 5 mmol/L)，37℃反應(yīng)30 min，酶活單位定義為每分鐘催化合成1 μg GSH所需的酶量。

1.6 實驗方案的確定

氧化刺激:選取H2O2和KMnO4兩種氧化劑對發(fā)酵過程中的酵母細胞進行氧化刺激，測定酵母細胞的生長情況、谷胱甘肽的產(chǎn)量。比較各項參數(shù)，確定這兩種物質(zhì)的最適添加濃度和最適添加時間。

高滲刺激:以NaCl和KCl兩種試劑給發(fā)酵中的酵母細胞以高滲環(huán)境，測定酵母細胞的生長情況、谷胱甘肽的產(chǎn)量及谷胱甘肽合成酶系酶活，確定最適濃度和最佳添加時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化刺激物對谷胱甘肽產(chǎn)量的影響

2.1.1 氧化刺激物對酵母細胞生長及谷胱甘肽產(chǎn)量的影響

由于培養(yǎng)基中的葡萄糖在前9 h內(nèi)基本耗光，細胞的生長趨于緩慢，谷胱甘肽的大量合成發(fā)生在細胞生長的中后期。因此，初步選擇發(fā)酵后9 h為氧化刺激物的添加點，確定選擇的刺激物對谷胱甘肽的生產(chǎn)是否有增產(chǎn)效果。由圖1和圖2可以看出雖然2種氧化劑對細胞的生長有一定的抑制作用，但卻都能明顯地提高谷胱甘肽的含量。這是因為在氧化應(yīng)激條件下，細胞啟動防御保護機制，產(chǎn)生較多的抗氧化劑。而對于酵母細胞來說，體內(nèi)的谷胱甘肽系統(tǒng)是保護細胞免受氧化劑損傷的主要機制［14］。

2.1.2 氧化刺激物的最佳添加量和添加時間

由圖3和圖4可以看出，無論是KMnO4還是H2O2都只能在一定濃度范圍內(nèi)提升谷胱甘肽產(chǎn)量。氧化刺激物濃度過高，不僅菌體的生長會受到抑制，而且生產(chǎn)的谷胱甘肽會大量消耗用于保護細胞，使得谷胱甘肽的產(chǎn)量迅速下降。由圖可以看出當KMnO4濃度在0.012 g/L左右、過氧化氫濃度在30 mmol/L左右時，廢酵母產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)量達到最大。

在確定了2種氧化刺激物的最佳添加濃度后，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)探討了這2種物質(zhì)發(fā)酵過程中的最佳添加時間。由于前9 h是酵母細胞的快速生長期，為了避免刺激物的添加阻滯細胞的生長引起后期谷胱甘肽合成受阻，因此將添加時間設(shè)計在9 h后。由圖5和圖6可以看出，對于KMnO4而言，添加時間越靠后越好，當添加時間為21 h時谷胱甘肽產(chǎn)量和比酶活均達到最大，產(chǎn)量高達512 mg/L，增產(chǎn)20%。而就H2O2來說，酶活和谷胱甘肽產(chǎn)量在發(fā)酵后12 h最大，此刻才是最佳的添加時間，產(chǎn)量達482.3 mg/L，增產(chǎn)13%。

2.2 高滲刺激對谷胱甘肽產(chǎn)量的影響

除了氧化劑會刺激酵母細胞，使得細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，生成相應(yīng)的保護性物質(zhì)。給予細胞高滲環(huán)境，也有產(chǎn)生類似的效果。本實驗選取KCl和NaCl兩種鹽溶液為細胞營造高滲環(huán)境，探索其對酵母細胞產(chǎn)谷胱甘肽的影響。

2.2.1 KCl和NaCl溶液對細胞生長及谷胱甘肽產(chǎn)量的影響

一定濃度的滲透處理對谷胱甘肽的產(chǎn)量會有所提高，但濃度過高會引起細胞脫水、質(zhì)壁分離甚至死亡，阻礙細胞的正常生理功能，進而影響谷胱甘肽的產(chǎn)量。由圖7可以看出當KCl和NaCl兩種溶液在發(fā)酵液中的濃度為15 g/L時，谷胱甘肽的產(chǎn)量達到最大，高達458.3 mg/L，相比未添加鹽溶液時的428.5 mg/L，產(chǎn)量有所提升。其中，KCl的增產(chǎn)效果要明顯好于NaCl，可能因為KCl中含有K+，該離子是許多酶的激活劑，有利于刺激谷胱甘肽合成中的相關(guān)酶類。鑒于KCl的效果要好于NaCl，后期選擇前者做進一步研究。

2.2.2 KCl溶液的最佳添加時間

由圖8可以看出，在發(fā)酵15 h后添加15 g/L的KCl，谷胱甘肽產(chǎn)量、酶活均達到最大。分析可能是該時間段是谷胱甘肽酶系大量合成的關(guān)鍵時期，KCl的加入進一步刺激了酶的合成，谷胱甘肽產(chǎn)量明顯增高。此時，谷胱甘肽產(chǎn)量達到475.2 mg/L，相比對照增產(chǎn)11.5%。

2.3 兩種刺激物的聯(lián)合使用

為了確定這兩類刺激物是否具有疊加效應(yīng)，現(xiàn)將兩類物質(zhì)聯(lián)合使用，分別考察了KMnO4和H2O2與KCl聯(lián)用時的增產(chǎn)效果。如圖9所示。

由圖9可以看出，兩類刺激物聯(lián)用并沒有產(chǎn)生疊加效應(yīng)，相反比起單用還略有下降。經(jīng)分析，可能是因為雖然刺激物可以促使細胞啟動防御機制產(chǎn)生谷胱甘肽，但同時過強的刺激也會加速產(chǎn)生的谷胱甘肽的消耗，從而使得增產(chǎn)效果大打折扣。

3 結(jié)論

綜合上述實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)氧化和高滲刺激都能一定程度地增加谷胱甘肽的產(chǎn)量。前者是因為氧化劑會促使細胞發(fā)生保護性反應(yīng)，產(chǎn)生抗氧化物質(zhì);后者是因為高滲環(huán)境改變了細胞的生理功能，刺激了谷胱甘肽相關(guān)酶系的活性。本實驗中，發(fā)酵21 h后添加0.012 g/L的KMnO4，谷胱甘肽的產(chǎn)量高達512 mg/L，增產(chǎn)20%;H2O2的最佳添加時間為發(fā)酵后12 h，最佳添加濃度為30 mmol/L左右，谷胱甘肽產(chǎn)量可達482.3 mg/L，增產(chǎn)13%;發(fā)酵15 h后用15 g/L的KCl溶液進行高滲刺激，谷胱甘肽產(chǎn)量提升至475.2 mg/L。兩種類型的刺激物單獨使用的效果要強于聯(lián)合使用，單獨使用KMnO4，谷胱甘肽的產(chǎn)量最高。

［1］ Mary E A.Glutathione:an overview of biosynthesis and Modulation ［J］.Chem Biol Interact，1998，11(2):1.

［2］ Yanping T，Wen J，Na G，et al.Inhibitory effects of glutathione on dengue virus production［J］.Biochem Bioph Res Co，2010，397(3):420.

［3］ LI Y，WEI G Y，CHEN J.Glutathione:a review on biotechnological production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2004，66(3):233.

［4］ Dringen R G J，Hirlinger J.Glutathione metabolism in the brain［J］.Biochem，2000，267(16):4912-4916.

［5］ Micke P B K，Schlaak JF，Buhl R.Oral supplementation with whey proteins increases plasma glutathione levels of HIV-infected patients［J］.Clin Invest，2001，31(2):171-178.

［6］ Roum J H，Buhl R，McElvaney N G，et al.Systemic deficiency of glutathione in cystic fibrosis［J］.Appl Physiol，1993，75(6):2419-2424.

［7］ WANG Z，TAN T W，SONG J.Effect of amino acids addition and feedback control strategies on the high-cell-density cultivation of Saccharomyces cerevisiae for glutathione production［J］.Process Biochem，2007，42(1):108.

［8］ WEI G，LI Y，DU G，et al.Effect of surfactants on extracellular accumulation of glutathione by Saccharomyces cerevisiae［J］.Process Biochem，2003，38(8):1 133.

［9］ WEN S H，ZHANG T，TAN T W.Maximizing production of glutathione by amino acid modulation and high-cell-density fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae［J］.Process Biochem，2006，41(12):2 424.

［10］ 張惟杰.糖復合物生化研究技術(shù)［M］.杭州:浙江大學出版社，1994:10.

［11］ T IETZE F.Enzymic method for quantitative determination of nano gram amounts of total and oxidized glutathione［J］.Anal Biochem，1969，27(3):502-522.

［12］ 趙少欣，賀小賢.還原型谷胱甘肽簡便測定法［J］.食品科技，2007，191(9):219-220.

［13］ 沈立新、魏東芝.谷胱甘肽合成酶系的克隆、測序及表達［J］. 生物工程學報，2001，17(1):98-100.

［14］ LIANG G B，LIAO X Y，DU G C，et al.A new strategy to enhance glutathione production by multiple H2O2-induced oxidative stresses in Candida utilis［J］.Bioresource Technol，2009，100(1):350.