蔡峰，吳小濤，王鋒

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院 脊柱外科，江蘇 南京 210009)

·綜 述·

椎間盤髓核細(xì)胞表型的研究進(jìn)展

蔡峰，吳小濤，王鋒

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中大醫(yī)院 脊柱外科，江蘇 南京 210009)

髓核細(xì)胞特異性表型是識(shí)別髓核細(xì)胞和研究其生物學(xué)行為的基礎(chǔ)，同時(shí)也是基因干預(yù)、細(xì)胞移植等生物學(xué)修復(fù)椎間盤退變的前提。髓核細(xì)胞兼有軟骨細(xì)胞和脊索細(xì)胞的表型特點(diǎn)，而特定基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控又廣泛受到椎間盤局部微環(huán)境以及椎間盤退行性變的影響。部分髓核細(xì)胞亞群還具有祖細(xì)胞的生物學(xué)特性并表達(dá)特定的表型。對(duì)髓核細(xì)胞表型的研究有助于推動(dòng)椎間盤退變生物學(xué)治療的進(jìn)展。

椎間盤退變；髓核細(xì)胞表型；軟骨細(xì)胞；脊索細(xì)胞；髓核祖細(xì)胞；文獻(xiàn)綜述

椎間盤退行性變是一個(gè)多因素參與的對(duì)椎間盤成分、結(jié)構(gòu)、功能漸進(jìn)性破壞的慢性過程。近年來，采用細(xì)胞移植、基因干預(yù)和細(xì)胞因子注射等生物學(xué)治療手段來恢復(fù)髓核細(xì)胞的數(shù)量和功能是研究的熱點(diǎn)[1-2]。但目前對(duì)髓核細(xì)胞表型的認(rèn)識(shí)仍局限于其表達(dá)軟骨表型：Ⅱ型膠原(COL2)和聚集蛋白聚糖(ACAN)。干細(xì)胞移植后是否能分化成為真正的髓核細(xì)胞，仍缺少鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)髓核細(xì)胞表型特征的全面認(rèn)識(shí)，有助于指導(dǎo)生物學(xué)治療。作者就髓核細(xì)胞表型的研究進(jìn)展作一綜述。

1 髓核細(xì)胞表型

1.1 髓核細(xì)胞表達(dá)軟骨表型

2002年Sive等首次在人椎間盤細(xì)胞中檢測(cè)出軟骨細(xì)胞表型COL2、ACAN和SOX9基因[3]。他還發(fā)現(xiàn)在正常髓核細(xì)胞中三者表達(dá)呈強(qiáng)陽性，而纖維環(huán)中略微表達(dá)或不表達(dá);在退變椎間盤髓核細(xì)胞中依然能表達(dá)SOX9，但是COL2和ACAN表達(dá)明顯降低，尤其是ACAN。盡管關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞中均表達(dá)COL1，且表達(dá)量在3種細(xì)胞中差異不明顯，但是結(jié)合COL2和ACAN的表達(dá)，仍能將髓核細(xì)胞與其他椎間盤細(xì)胞相區(qū)別[4]。此外，Clouet等[4]還分別比較了兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、纖維環(huán)細(xì)胞和髓核細(xì)胞中COL2/COL1、COL2/ACAN的兩個(gè)比值，發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟骨和髓核細(xì)胞中，COL2/COL1值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于纖維環(huán)細(xì)胞(關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞≈1 800，髓核細(xì)胞≈1 000，纖維環(huán)細(xì)胞≈1)，說明在關(guān)節(jié)軟骨和髓核細(xì)胞中主要以COL2為主，而纖維環(huán)中則以COL1為主。在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中COL2/ACAN值又遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于髓核細(xì)胞(關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞≈1 100，髓核細(xì)胞≈1)，提示高表達(dá)ACAN是髓核細(xì)胞的顯著特征。

1.2 髓核細(xì)胞表達(dá)脊索細(xì)胞的表型

脊索細(xì)胞是胚胎發(fā)育過程中脊索的殘留物，細(xì)胞體積較大(直徑30～40 μm)，通常以團(tuán)狀出現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)含有空泡，至少占細(xì)胞總體積的25%。在人類，脊索細(xì)胞隨著年齡的增加而丟失，青春期以后就很難檢測(cè)到，然而在鼠類、兔子等動(dòng)物體內(nèi)這些細(xì)胞卻能長久保留。

有研究顯示，盡管成人髓核中罕見具有空泡特征的脊索樣髓核細(xì)胞存在，但卻能檢測(cè)到脊索細(xì)胞特征性表型分子表達(dá)，如：T基因，細(xì)胞角蛋白-8、-18、-19(CK-8、-18、-19)，半乳凝素-3(Gal-3)，配對(duì)盒基因1(PAX1)和叉頭盒基因1(FOXF1)。T基因(又稱Brachyury)編碼的蛋白質(zhì)是一個(gè)胚胎期的核轉(zhuǎn)錄因子，影響中胚層形成和分化所需基因的轉(zhuǎn)錄[5]。這個(gè)蛋白存在于脊索來源的細(xì)胞中，被認(rèn)為是在胚胎期或脊索瘤中調(diào)節(jié)軟骨形成，是脊索分化和生長過程所必需的[6]。

Minogue等[7]利用密度梯度離心法分離牛髓核細(xì)胞和脊索細(xì)胞，并用RT-PCR檢測(cè)兩種細(xì)胞中T基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)T基因在脊索和髓核細(xì)胞中均表達(dá)，兩者差異不超過10倍，同時(shí)在髓核細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于關(guān)節(jié)軟骨(≈100倍)和AF(≈50倍)，并且其表達(dá)量不因髓核退變程度的增加而減少。

此外，髓核細(xì)胞還表達(dá)CK-8、-18、-19，Gal-3等脊索細(xì)胞表型，盡管與脊索細(xì)胞相比，其表達(dá)量在髓核細(xì)胞中略低，但差異不超過10倍[7-10]。然而，在髓核細(xì)胞CK-8、-18、-19的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在纖維環(huán)(CK-8≈2 544倍，CK-18≈1 860倍，CK-19≈50倍)和關(guān)節(jié)軟骨(CK-8≈7 600倍，CK-18≈15 990倍，CK-19≈36倍)[7]。這些基因在髓核、纖維環(huán)和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞間的差異表達(dá)使它們可能成為髓核細(xì)胞特征性的表型。T基因，CK-8、-18、-19以及Gal-3的高表達(dá)不僅可以將髓核細(xì)胞與纖維環(huán)細(xì)胞或軟骨終板細(xì)胞相區(qū)別，而且在一定程度上提示髓核細(xì)胞來源于胚胎發(fā)育過程中脊索細(xì)胞在椎間盤內(nèi)的殘留[7]。

胚胎發(fā)育過程中椎間盤以及髓核組織的形成受到嚴(yán)格的信號(hào)調(diào)控。Choi等發(fā)現(xiàn)，表達(dá)shh基因的脊索細(xì)胞形成髓核組織，但對(duì)纖維環(huán)和終板的形成不是必須的[11]。在沒有shh參與下，髓核細(xì)胞就不能表達(dá)其表型，而纖維環(huán)和終板軟骨細(xì)胞則能表達(dá)，但有所減少[12]。研究發(fā)現(xiàn)， PAX1和FOXF1這兩個(gè)基因的表達(dá)是由shh信號(hào)軸激活的[13]。PAX1參與胚胎期調(diào)節(jié)椎間盤生成，F(xiàn)OXF1與椎間盤細(xì)胞生長、增殖有關(guān)[14-15]。在人髓核細(xì)胞中，PAX1和FOXF1基因的表達(dá)量分別是軟骨細(xì)胞的2 000倍和100倍。PAX1和 FOXF1在髓核細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中的表達(dá)差異進(jìn)一步提示，髓核細(xì)胞起源于脊索細(xì)胞，并繼承了脊索細(xì)胞的表型特征。

1.3 髓核細(xì)胞表達(dá)環(huán)境相關(guān)性基因

髓核細(xì)胞中表達(dá)一些與椎間盤缺血缺氧環(huán)境相關(guān)的基因，比如低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(GULT-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF-A)、碳酸酐酶-12(CA12)和血紅蛋白β鏈(HBB)。HIF-1是低氧誘導(dǎo)結(jié)合蛋白，是一種堿基-螺旋-環(huán)袢-螺旋PAS異二聚蛋白質(zhì)，有α、β兩個(gè)亞基構(gòu)成。富氧狀態(tài)下HIF-1α很快被降解，而缺氧狀態(tài)下HIF-1α穩(wěn)定，并進(jìn)入細(xì)胞核，與HIF-1β結(jié)合后激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。Rajpurohit比較了髓核、纖維環(huán)和終板軟骨中HIF-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在三者中均表達(dá)HIF-1β，但是只有在髓核細(xì)胞中表達(dá)HIF-1α[16]。GULT-1、VEGF-A和CA12受HIF-1α的調(diào)控，三者在髓核細(xì)胞中高表達(dá)，而在纖維環(huán)和軟骨細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，GULT-1能夠提高髓核細(xì)胞攝取葡萄糖能力，用以糖酵解和合成糖蛋白，VEGF-A具有促血管生成和促有絲分裂的作用，CA12是髓核細(xì)胞表面分子，用以維持細(xì)胞內(nèi)pH值[17-18]。

1.4 髓核細(xì)胞表面特征性的CD分子

研究發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞特征性地表達(dá)一些CD分子，高表達(dá)CD24、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，幾乎不表達(dá)CD34、CD14、CD45和CD133(表1)，其中CD24被認(rèn)為是髓核細(xì)胞特異性的標(biāo)記[19]。Fujita等[20]發(fā)現(xiàn)，CD24在人髓核細(xì)胞的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于纖維環(huán)、軟骨、骨、皮膚等9種組織，并且在突出髓核與正常髓核中表達(dá)無明顯差異。另外，他們還發(fā)現(xiàn)在脊索細(xì)胞來源的脊索瘤組織中高表達(dá)CD24，而間葉組織來源的軟骨瘤組織卻不表達(dá)CD24。

1.5 髓核細(xì)胞鑒定時(shí)的陰性標(biāo)記

Minogue等[9]運(yùn)用基因芯片和RT-PCR技術(shù)篩選出4個(gè)在人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于髓核細(xì)胞中表達(dá)的基因：生長分化因子10(GDF10)、骨唾液酸糖蛋白(IBSP)、細(xì)胞因子1(CYTL1)、纖蛋白1(FBLN1)。這些基因在關(guān)節(jié)軟骨和髓核細(xì)胞中表達(dá)差異在100倍以上，因此，Minogue認(rèn)為這些基因在髓核細(xì)胞中表達(dá)陰性而在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)陽性，是鑒定髓核細(xì)胞的陰性標(biāo)記。

表1 CD分子在髓核細(xì)胞中表達(dá)情況

2 正常和退變髓核細(xì)胞中表型差異

退變髓核細(xì)胞通過調(diào)控某些基因的表達(dá)量，最終使細(xì)胞內(nèi)分解代謝增加，合成代謝減少，細(xì)胞功能減退。其中表達(dá)上調(diào)的基因主要有骨母細(xì)胞特異性因子-2(periostin)、COL1、基質(zhì)Gla蛋白(MGP)、FBLN1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9(MMP-2、-9)，下調(diào)的基因主要有COL2、ACAN、SOX9、突觸小體相關(guān)蛋白(SNAP25)、神經(jīng)-鈣黏素CDH2和CK-8、-18、-19[21-22]。

Periostin是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，具有細(xì)胞黏附功能，在組織生長和損傷修復(fù)過程中促進(jìn)膠原產(chǎn)生和有效交聯(lián)，但同時(shí)Periostin還與整聯(lián)蛋白αvβ3結(jié)合，誘導(dǎo)下游基因磷酸化，最終導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度表達(dá)COL1，促使病變組織纖維化[21]。此外，Periostin與MMP-2前體結(jié)合，能促進(jìn)其水解，形成有活性的MMP-2，兩者在退變髓核細(xì)胞中表達(dá)量顯著增加并且成正相關(guān)[21]。MGP是一種表達(dá)于骨和軟骨中的維生素K依賴蛋白，在軟骨內(nèi)成骨、病理性鈣化和骨折愈合過程中上調(diào)表達(dá)。隨著髓核細(xì)胞的逐漸老化，MGP的表達(dá)增加，Lee等發(fā)現(xiàn)，在年輕人(<54歲)髓核細(xì)胞中用免疫組化法不能檢測(cè)出MGP表達(dá)，而在退變的老年人髓核細(xì)胞中可以檢測(cè)到MGP的表達(dá)[8，10]。FBLN1在正常髓核細(xì)胞和纖維環(huán)細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但是在退變椎間盤細(xì)胞中表達(dá)明顯增加。FBLN1能增強(qiáng)血小板反應(yīng)蛋白-1 (ADAMTS-1)分解蛋白多糖的能力，減少細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白多糖的含量，加速椎間盤退變的發(fā)展[7]。

SOX9、COL2、ACAN 3個(gè)基因是經(jīng)典的軟骨細(xì)胞表型，在退變髓核細(xì)胞中，三者表達(dá)明顯降低[3，21]。SOX9是軟骨表型的主要調(diào)控基因，能有效促進(jìn)ACAN的表達(dá)，在椎間盤退變中SOX9表達(dá)下降以及MMP表達(dá)升高，COL2和ACAN合成減少，分解增加。Minogue等首次發(fā)現(xiàn)在牛髓核細(xì)胞中表達(dá)SNAP25和CDH2，而在關(guān)節(jié)軟骨中幾乎不表達(dá)，并且隨著椎間盤的退變，髓核細(xì)胞中SNAP25和CDH2的表達(dá)量逐漸降低[7]。SNAP25參與細(xì)胞膜融合和胞吐過程，CDH2在間充質(zhì)性凝聚物和軟骨形成過程中起重要作用，但是兩者在髓核細(xì)胞中的作用還不明確。

3 髓核祖細(xì)胞表型

近年來，越來越多的研究認(rèn)為在椎間盤中可能存在髓核祖細(xì)胞，這種細(xì)胞與軟骨樣髓核細(xì)胞不同，它具有增殖能力，表達(dá)增殖細(xì)胞核心抗原PCNA，并且具有多向分化潛能。髓核祖細(xì)胞表達(dá)胚胎干細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞特征性的表型，比如Oct3/4、Sox2、Nanog、CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)、Notch1和Jagged1。這些基因在細(xì)胞增殖和分化中起調(diào)控作用，使髓核祖細(xì)胞能夠維持干細(xì)胞的一些特性。

Oct3/4、Sox2和Nanog是調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的3個(gè)具有代表性的轉(zhuǎn)錄因子，Oct3/4在胚胎干細(xì)胞中處于調(diào)節(jié)細(xì)胞全能性的頂層位置，其與Sox2、Nanog通過參與LIF-STAT、BMP、Wnt等信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)胚胎干細(xì)胞中的管家基因進(jìn)行調(diào)控，從而保持胚胎干細(xì)胞的全能性[23-24]。Erwin等發(fā)現(xiàn)，Oct3/4、Sox2、Nanog這3個(gè)基因在髓核祖細(xì)胞中表達(dá)，并且其在髓核祖細(xì)胞中的表達(dá)量比MSC中高[25]。

CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)是MSC和造血祖細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記，他們參與維持干細(xì)胞的自我更新和增殖。Yasen發(fā)現(xiàn)，在兔髓核祖細(xì)胞中CD133、C-KIT、CD166(ALCAM)在RNA和蛋白水平均有明顯表達(dá)，同時(shí)隨著年齡的增加，表達(dá)量下降。因此，這3個(gè)基因也可以作為髓核祖細(xì)胞的鑒定標(biāo)記[26]。

Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑在無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中廣泛存在且高度保守。此途徑介導(dǎo)由局部細(xì)胞間相互作用而產(chǎn)生的、對(duì)多種不成熟細(xì)胞分化的抑制信號(hào)， 在胚胎發(fā)育中起重要作用。Notch1、Jagged1是參與Notch信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白分子，它們?cè)谒韬俗婕?xì)胞中的表達(dá)，抑制髓核祖細(xì)胞的分化，使其保持干細(xì)胞特性[26]。

此外，Sakai利用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在髓核中表達(dá)酪氨酸激酶受體(Tie2)和雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GD2)的細(xì)胞具有增殖能力和分化潛能，因此,他認(rèn)為這類細(xì)胞就是髓核祖細(xì)胞。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在髓核中存在如圖1所示的分化過程[27]。

圖1 髓核祖細(xì)胞分化過程

其中Tie2+GD2-CD24-和Tie2+GD2+CD24-是具有多向分化能力的祖細(xì)胞，他們都表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特征性的分子CD271(>75%)[28]。CD24是髓核細(xì)胞表型，當(dāng)CD24陽性時(shí)，髓核祖細(xì)胞即已分化成穩(wěn)定的髓核細(xì)胞。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化

目前用于治療椎間盤退變的干細(xì)胞主要有：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)、脂肪干細(xì)胞(AD-MSC)和滑膜干細(xì)胞(SMSC)。這些細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下能分化成類髓核細(xì)胞，上調(diào)COL2與ACAN合成。

研究發(fā)現(xiàn)，人BM-MSC在殼聚糖-甘油磷酸水凝膠中誘導(dǎo)后或者移植入牛椎間盤后，細(xì)胞成類髓核分化，COL2/ACAN值接近于髓核細(xì)胞，并且不表達(dá)成骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞特征性表型[29]。Minogue將AD-MSC和BM-MSC誘導(dǎo)分化后用RT-PCR和免疫組化法檢測(cè)髓核細(xì)胞陽性標(biāo)記COL2A1、ACAN、PAX1及FOXF1，陰性標(biāo)記IBSP、FBLN1，結(jié)果顯示兩種細(xì)胞均上調(diào)表達(dá)COL2A1、ACAN、PAX1、FOXF1，但是BM-MSC同時(shí)上調(diào)表達(dá)IBSP、FBLN1，表現(xiàn)出類似于軟骨細(xì)胞的特點(diǎn)，而AD-MSC卻不表達(dá)[9]。以上結(jié)論在一定程度上說明，AD-MSC分化后與髓核細(xì)胞的標(biāo)記更吻合，進(jìn)而推斷AD-MSC可能是更適合的種子細(xì)胞。體外研究已證實(shí)SMSC在與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)具有類髓核分化能力[30]，但是其分化后的表型譜目前暫無報(bào)道。綜上所述，深入認(rèn)識(shí)髓核細(xì)胞的表型特征有助于理解間充質(zhì)干細(xì)胞在髓核微環(huán)境中的分化過程與修復(fù)機(jī)制。

5 展 望

目前關(guān)于鑒定髓核細(xì)胞還沒有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，髓核細(xì)胞在椎間盤中具有軟骨樣細(xì)胞作用，同時(shí)又表達(dá)脊索細(xì)胞特性，并且在椎間盤特殊的微環(huán)境中表達(dá)特定的表型。這些特性是未來確定髓核細(xì)胞表型的基礎(chǔ)。此外，不容忽視的是髓核中存在髓核祖細(xì)胞，這類細(xì)胞可能是未來椎間盤退變生物學(xué)治療的重要種子細(xì)胞。

目前用于椎間盤退變生物學(xué)治療的種子細(xì)胞主要是間充質(zhì)干細(xì)胞，雖然它可以分化為具有功能的類髓核細(xì)胞，但是這種類髓核細(xì)胞與正常髓核細(xì)胞的表型特點(diǎn)并不能完全吻合。因此，對(duì)髓核細(xì)胞表型的準(zhǔn)確全面認(rèn)識(shí)，是未來進(jìn)一步尋找最適種子細(xì)胞以及探索其最適分化條件的前提。

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2014-11-01

2014-12-29

國家自然基金資助項(xiàng)目(81272035，81201423)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金和江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目(KYLX_0202)

蔡峰(1987-)，男，江蘇吳江人，在讀博士研究生。E-mail: cfspine@163.com

吳小濤 E-mail: wuxiaotao@medmail.com.cn

蔡峰，吳小濤，王鋒.椎間盤髓核細(xì)胞表型的研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：443-447.

R681.53

A

1671-6264(2015)03-0443-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.028