李子惠，柏盈盈，居勝紅

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分子與功能影像實驗室，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 放射科，江蘇 南京 210009)

·論 著·

內(nèi)皮祖細(xì)胞對氧糖剝奪/復(fù)氧損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用

李子惠1，柏盈盈1，居勝紅2

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 分子與功能影像實驗室，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 放射科，江蘇 南京 210009)

目的:研究內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)共培養(yǎng)對氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)損傷神經(jīng)元是否有保護(hù)作用。方法:分離培養(yǎng)新生小鼠的海馬神經(jīng)元，利用缺氧培養(yǎng)室建立神經(jīng)元OGD/R模型。分離培養(yǎng)小鼠骨髓源性EPCs，采用Transwell小室建立EPCs與OGD/R損傷神經(jīng)元的共培養(yǎng)系統(tǒng)。將神經(jīng)元隨機(jī)分為4組，即對照組、OGD/R組、EPCs共培養(yǎng)組及EPCs共培養(yǎng)并加入一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑(L-NAME)組。神經(jīng)元凋亡率用TUNEL熒光法檢測。用Western blot法檢測神經(jīng)元caspase 3及內(nèi)皮型eNOS活性。結(jié)果：OGD/R組神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡率和caspase 3活性較對照組顯著增加。與OGD/R組相比，EPCs共培養(yǎng)組神經(jīng)元凋亡情況顯著降低(P<0.05),且eNOS磷酸化水平明顯增高(P<0.05)。而與EPCs共培養(yǎng)組相比，EPCs+L-NAME組神經(jīng)元凋亡情況明顯增加(P<0.05)，且eNOS磷酸化水平也明顯下降(P<0.05)。結(jié)論：與EPCs共培養(yǎng)可以通過提高神經(jīng)元eNOS的活性來保護(hù)OGD/R損傷的神經(jīng)元。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；神經(jīng)元；氧糖剝奪/復(fù)氧；共培養(yǎng)；內(nèi)皮型一氧化氮合酶

腦卒中是全球第二大致死性疾病，其中80%為缺血性腦卒中[1]。應(yīng)用重組組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)是治療急性腦卒中的主要方法[2]，但時間依賴性極強(qiáng)[3]，且患者遠(yuǎn)期存活率無明顯改善[4]。因此，亟待尋找治療腦卒中的新方法。腦卒中早期及時挽救缺血半暗帶內(nèi)的神經(jīng)元有利于患者神經(jīng)功能的改善和恢復(fù)，是目前腦卒中治療的關(guān)鍵[5]。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)對缺血缺氧組織有定向歸巢的特性，研究表明小鼠心肌梗死后移植EPCs可通過上調(diào)一氧化氮合酶(eNOS)活性來促進(jìn)心臟功能的恢復(fù)[6]。通過上調(diào)eNOS/BDNF通路，原代神經(jīng)元缺血缺氧性損傷可有所改善[7]。研究證明，移植EPCs可改善腦卒中小鼠的愈后[8]，但具體的作用機(jī)制尚不明確。我們設(shè)想體外EPCs共培養(yǎng)能通過提高神經(jīng)元eNOS活性來保護(hù)氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen and glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)損傷的神經(jīng)元，故進(jìn)行了實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

新生C57BL/6乳鼠，SPF級。C57BL/6小鼠，4周齡，體重10～12 g，SPF級，雄性。購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動物許可證編號scxk(蘇)2012-0004。

Neurobasal-A/B27培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，EGM-2 MV培養(yǎng)基(美國Vector Laboratries公司)，anti-β-Tubulin Ⅲ 兔抗小鼠抗體(美國Sigma公司)，Dil-Ac-LDL(美國Biomedical Technologies公司)，F(xiàn)ITC-UEA-1(美國Sigma公司)，anti-CD34、anti-CD133、anti-VEGFR-2、anti-active+pro Caspase 3、anti-eNOS及anti-p-eNOS兔抗小鼠抗體(美國Abcam公司)，AlexaFluo 488/594羊抗兔二抗(美國Abcam公司)，TUNEL試劑盒(美國Roche公司)，L-NAME(美國Sigma公司)。

缺氧培養(yǎng)室(日本三菱)，Transwell小室(美國Millipore公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)，Tanon5200化學(xué)發(fā)光成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1神經(jīng)元的培養(yǎng)及鑒定 參照Kaech[9]的方法，取新生C57BL/6乳鼠消毒后斷頭取腦，分離兩側(cè)海馬并剪成小塊。胰酶消化20 min，加入血清輕柔吹打分散細(xì)胞。離心5 min后棄上清液，用含血清DMEM/F12培養(yǎng)基重懸。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106個·ml-1，加入PLL包被的6孔板。4 h后將培養(yǎng)基換成Neurobasal-A/B27，以后每3 d半量換液。

取第8天的神經(jīng)元爬片行抗β-Tubulin Ⅲ抗體免疫熒光染色[10]，熒光顯微鏡下隨機(jī)選取3個高倍鏡視野，計算β-Tubulin Ⅲ陽性細(xì)胞占90%以上。

1.2.2神經(jīng)元OGD/R模型 隨機(jī)選取6孔板的神經(jīng)元，將培養(yǎng)基換成無糖Earle′s液，放入缺氧培養(yǎng)室，半小時后缺氧室內(nèi)氧氣含量小于0.1%。氧糖剝奪4 h后取出細(xì)胞，恢復(fù)到正常培養(yǎng)條件24 h。

1.2.3EPCs的培養(yǎng)及鑒定 參考Bai等[11]的方法， 取4周齡C57BL/6小鼠頸椎脫臼法處死，依次置于碘伏、酒精中消毒。分離兩側(cè)股骨和脛骨，PBS沖洗骨髓腔并分散細(xì)胞。將細(xì)胞懸液加到淋巴細(xì)胞分離液上，以2 500 r·min-1離心30 min后收集中間白色云霧層。PBS離心洗滌，EGM-2 MV培養(yǎng)基重懸，接種到FN包被的培養(yǎng)瓶中，以后每4 d換液，待細(xì)胞鋪滿瓶底后傳代。取生長良好的EPCs以1×106個·ml-1的密度接種于Transwell小室備用。

觀察細(xì)胞生長情況，取生長良好的第2代EPCs行抗CD34、CD133、VEGFR-2抗體免疫熒光染色。另一方面取生長良好的EPCs，細(xì)胞免疫熒光法檢測其內(nèi)吞Dil-ac-LDL及結(jié)合FITC-UEA-1的功能，統(tǒng)計得雙陽性細(xì)胞占90%以上。

1.2.4實驗分組 實驗隨機(jī)分為4組:(1) 對照組；(2) OGD/R組；(3) EPCs共培養(yǎng)組；(4) EPCs共培養(yǎng)并加入eNOS抑制劑(Nω-nitro-L-arginine methyl ester， L-NAME)組。

1.2.5共培養(yǎng)方法 EPCs組神經(jīng)元氧糖剝奪4 h后恢復(fù)到正常培養(yǎng)環(huán)境中，并插入接種了EPCs的Transwell小室進(jìn)行24 h共同培養(yǎng)。EPCs+L-NAME組是在EPCs共同復(fù)氧的同時加入L-NAME，終濃度約1 μmmol·L-1。

1.2.6TUNEL神經(jīng)元凋亡檢測 步驟按照Roche TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書。各組用激光共聚焦顯微鏡隨機(jī)取7個100倍鏡視野計算陽性細(xì)胞比例。

1.2.7Western blot法測定神經(jīng)元的active caspase 3及p-eNOS的相對表達(dá)情況 提取各組神經(jīng)元總蛋白，每組取等量樣本經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，室溫下封閉2 h。加入一抗，4 ℃孵育過夜。洗膜后加入二抗，室溫下孵育2 h。應(yīng)用Tanon 5200系統(tǒng)曝光成像，測量灰度值，每組重復(fù)3次。使用的一抗有anti-active+pro Caspase 3(1∶1 000)、anti-eNOS(1∶1 000)、anti-p-eNOS(1∶1 000)、anti-β-actin(1∶2 000)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元及EPCs的形態(tài)、鑒定

神經(jīng)元培養(yǎng)8 d后分化成熟，突起互相交織成網(wǎng)狀(圖1A、B)且抗β-Tubulin Ⅲ免疫熒光鑒定顯示紅色熒光主要位于胞質(zhì)及突起內(nèi)(圖1C)。

A.神經(jīng)元培養(yǎng)第8天(bar=50 μm)；B.神經(jīng)元培養(yǎng)第8天(bar=20 μm)；C.神經(jīng)元抗β-Tubulin Ⅲ 抗體免疫熒光鑒定(bar=30 μm)

圖1 海馬神經(jīng)元的形態(tài)及鑒定

EPCs培養(yǎng)4 d后貼壁細(xì)胞較分散，呈紡錘形或不規(guī)則形(圖2A)。EPCs培養(yǎng)10 d后細(xì)胞鋪滿瓶底，呈典型的“鋪路石”狀(圖2B)，且均表達(dá)CD34、CD133、VEGFR-2特異性標(biāo)志物(圖2C)，同時細(xì)胞能內(nèi)吞Dilac-LDL并結(jié)合FITC-UEA-1(圖2D)。

2.2 EPCs共培養(yǎng)及L-NAME對神經(jīng)元凋亡率的影響

各組神經(jīng)元TUNEL熒光染色見圖3A。對照組神經(jīng)元凋亡率低(3.29%±0.81%)，OGD/R組凋亡率明顯增加(24.87%±1.96%)。EPCs組神經(jīng)元凋亡率(13.53%±3.04%)較OGD/R組減低(P<0.05)。而EPCs+L-NAME組神經(jīng)元凋亡率(17.90%±3.91%)較EPCs組又有所增加(P<0.05)。見圖3B。

2.3 EPCs共培養(yǎng)及L-NAME對神經(jīng)元active caspase 3相對表達(dá)水平的影響

將對照組神經(jīng)元經(jīng)pro caspase 3校正后的active caspase 3相對表達(dá)水平設(shè)為1。OGD/R組神經(jīng)元active caspase 3相對表達(dá)水平較對照組明顯提高。EPCs組較OGD/R組顯著下降(P<0.05)。而EPCs+L-NAME組較EPCs組有提高(P<0.05)。見圖4及表1。

A.EPCs培養(yǎng)第4天(bar=50 μm)；B.EPCs培養(yǎng)第10天(bar=50 μm)；C.EPCs特異性表面標(biāo)志物鑒定(bar=30 μm)；D.EPCs功能學(xué)鑒定(bar=30 μm)

圖2 內(nèi)皮祖細(xì)胞的形態(tài)及鑒定

2.4 EPCs共培養(yǎng)及L-NAME對神經(jīng)元p-eNOS相對表達(dá)水平的影響

將對照組神經(jīng)元經(jīng)eNOS校正后的p-eNOS相對表達(dá)水平設(shè)為1。OGD/R組神經(jīng)元p-eNOS相對表達(dá)水平較對照組下降，EPCs組較OGD/R組顯著提高(P<0.05)，而EPCs+L-NAME組較EPCs組又有所下降(P<0.05)。見圖5及表1。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，EPCs組與OGD/R組比較，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率及active caspase 3相對表達(dá)水平均顯著降低，充分說明EPCs共培養(yǎng)對缺血缺氧損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。而加入L-NAME后，細(xì)胞凋亡率及active caspase 3相對表達(dá)水平較EPCs組均顯著提高，說明EPCs對神經(jīng)元的保護(hù)作用有所減弱，提示EPCs可能通過eNOS保護(hù)神經(jīng)元。為進(jìn)一步驗證實驗設(shè)想，檢測各組神經(jīng)元p-eNOS及eNOS表達(dá)水平，p-eNOS為eNOS活性形式，結(jié)果表明EPCs組神經(jīng)元p-eNOS相對表達(dá)水平較OGD/R組顯著提高，而加入L-NAME后p-eNOS相對表達(dá)水平較EPCs組明顯降低，說明p-eNOS在EPCs保護(hù)損傷神經(jīng)元的過程中具有重要作用。

研究證明eNOS/BDNF通路在小鼠腦卒中后的神經(jīng)發(fā)生[12]及腦白質(zhì)修復(fù)[13]中發(fā)揮重要作用，另有研究顯示，移植EPCs能促進(jìn)腦卒中小鼠神經(jīng)元軸突的生長及神經(jīng)發(fā)生[14]，這些與本實驗結(jié)果相一致。但Transwell小室中EPCs細(xì)胞無法通過聚酯膜，所以可能是EPCs分泌的細(xì)胞因子或信號分子促進(jìn)了神經(jīng)元內(nèi)p-eNOS的表達(dá)，但具體尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

A.各組神經(jīng)元TUNEL熒光染色圖(bar=100 μm)；B.定量計算各組神經(jīng)元凋亡率；與OGD/R組比較，aP<0.05；與EPCs組比較，bP<0.05

圖3 神經(jīng)元凋亡率檢測

與OGD/R組比較，aP<0.05；與EPCs組比較，bP<0.05

圖4 神經(jīng)元active caspase 3相對表達(dá)水平

與OGD/R組比較，aP<0.05；與EPCs組比較，bP<0.05

與OGD/R組比較，aP<0.05；與EPCs組比較，bP<0.05

圖5 神經(jīng)元p-eNOS相對表達(dá)水平

一氧化氮合酶(NOS)存在3種亞型，即內(nèi)皮型(eNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)及神經(jīng)元型(nNOS)。本研究使用的L-NAME為非特異性NOS抑制劑，可同時抑制eNOS以外亞型的活性。抑制iNOS、nNOS能減少腦卒中小鼠神經(jīng)元的損失[7]，其保護(hù)作用中和了抑制eNOS的損傷作用，但總體仍表現(xiàn)出抑制eNOS的損傷作用。后期實驗可改進(jìn)為使用eNOS特異性抑制劑L-NIO或者eNOS-/-小鼠，來排除干擾。

本研究通過建立體外EPCs與氧糖剝奪/復(fù)氧損傷神經(jīng)元的共培養(yǎng)，觀察到EPCs能顯著提高神經(jīng)元的p-eNOS相對表達(dá)水平，從而降低損傷神經(jīng)元的active caspase 3相對表達(dá)水平及凋亡率，而加入L-NAME后EPCs的保護(hù)作用減弱，證明EPCs能通過提高神經(jīng)元eNOS活性保護(hù)缺血缺氧損傷的神經(jīng)元，并為EPCs治療腦卒中的機(jī)制提供新的解釋。

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Protective effect of endothelial progenitor cells on oxygen and glucose deprivation/reoxygenation injured neurons

LI Zi-hui1，BAI Ying-ying1，JU Sheng-hong2

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMolecularandFunctionalImaging，MedicalSchool，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.DepartmentofRadiology，ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To investigate whether endothelial progenitor cells(EPCs) co-culture has protective effect on oxygen and glucose deprivation/reoxygenation(OGD/R) injured neurons. Methods: Hippocampal neurons were isolated and cultured from newborn mice， and OGD/R model of neurons was performed using a hypoxia chamber. EPCs were isolated from the bone marrow of mice， and Transwell was used to build the co-culture system of EPCs and the OGD/R injured neurons. Neurons were randomly divided into four groups:the control group， the OGD/R group， the EPCs co-culture group and the EPCs+nitric oxide synthase inhibitor(L-NAME) group. Neuronal apoptosis rate was detected by TUNEL assay. Western blot was used to detect caspase 3 and endothelial nitric oxide synthase(eNOS) activity. Results: Neuronal caspase 3 activity and apoptosis rate were significantly increased in the OGD/R group compared with the control group. Neuronal apoptosis was significantly decreased and eNOS phosphorylation was increased in the EPCs co-culture group compared with the OGD/R group. However， the EPCs+L-NAME group showed increased neuronal apoptosis and decreased eNOS phosphorylation compared with the EPCs co-culture group. Conclusion: EPCs co-culture can protect OGD/R injured neurons by promoting the activation of eNOS.

endothelial progenitor cells; neurons; oxygen glucose deprivation/reoxygenation; co-culture; endothelial nitric oxide synthase

2014-12-26

2015-02-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(81371538)

李子惠(1989-)，女，江蘇泰州人，在讀碩士研究生。E-mail:zihuili0731@hotmail.com

居勝紅 E-mail:jsh0836@hotmail.com

李子惠，柏盈盈，居勝紅.內(nèi)皮祖細(xì)胞對氧糖剝奪/復(fù)氧損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：347-352.

R743.3

A

1671-6264(2015)03-0347-06

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.003