蔣亮，劉春輝，許斌，陳明

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué) 附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

·論 著·

miR-146a通過抑制ROCK 1基因的表達促進去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞的凋亡

蔣亮1，劉春輝1，許斌2，陳明2

(1.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009；2.東南大學(xué) 附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009)

目的:探討miRNA-146a對激素非依賴前列腺癌細(xì)胞DU145、PC3凋亡的影響極其作用機制。方法:通過Hoechst染色方法觀察高表達miRNA-146a對前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響。通過免疫印跡法(Western blot)觀察高表達miRNA-146a對cleave-caspase 3表達的影響。構(gòu)建ROCK1 3′UTR報告基因質(zhì)粒，合成miRNA-146a minics，分別共轉(zhuǎn)染DU145、PC3兩種前列腺癌細(xì)胞，采用熒光素酶報告基因(Luciferase)實驗檢測miR-146a是否與ROCK1相結(jié)合，采用免疫印跡法(Western blot)檢測miR-146a干擾后ROCK1蛋白量的表達。結(jié)果：Hoechst染色顯示，轉(zhuǎn)染miRNA 146a后可以促進DU145和PC3的凋亡。高表達miR-146a后cleave-caspase 3 表達增加。Luciferase及Western blot顯示，miR-146a通過與靶基因ROCK1 3′UTR的結(jié)合抑制ROCK1的表達。結(jié)論：ROCK1是miR-146a的靶基因，miR-146a通過抑制ROCK1基因的表達促進前列腺細(xì)胞的凋亡。

前列腺癌；Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1；細(xì)胞凋亡

前列腺癌(prostate cancer， PCa)是西方國家男性常見惡性腫瘤之一，在美國，其發(fā)病率在所有男性惡性腫瘤中居第1位[1]。年齡是PCa最主要的危險因素[2]，隨著我國進入老齡化社會，我國PCa的發(fā)病率正逐年上升。研究PCa的發(fā)生發(fā)展的分子機制有著十分重要的意義。既往研究表明，miRNA在PCa的發(fā)生發(fā)展中有著十分重要的作用。miRNA是一類長度約為22 nt的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小分子RNA，主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達[3]。在人類基因組中，miRNAs調(diào)控大約1/3的蛋白編碼基因，控制細(xì)胞的增殖、分化與凋亡活動。一些研究表明，miR-146a在激素非依賴PCa中呈低表達。本實驗擬通過相關(guān)實驗方法檢測miR-146a對PCa細(xì)胞凋亡的影響及miR-146a干擾后ROCK1蛋白量的表達。進一步明確miR-146a在去勢抵抗性PCa凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 PCa細(xì)胞DU145、PC3均購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑 胎牛血清購自HyClone公司， F12、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。Lipofectamin 2000試劑購自Invitrogen公司，psiCHECK-2質(zhì)粒由南京醫(yī)科大學(xué)惠贈，Top10感受態(tài)細(xì)胞購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，NotⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶和T4連接酶購自TaKaRa公司，Hoechst、Luciferase、BCA、ECL發(fā)光試劑盒購自碧云天公司，高純度質(zhì)粒中量小提試劑盒購自天根生化科技有限公司。鼠抗人ROCK1 抗體購自Abcam公司，兔抗人cleave-caspase 3抗體購自Cell Signaling Technology公司，兔抗人GAPDH抗體購自SantaCruz公司，辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 以含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25%的胰酶消化細(xì)胞，每周傳代2～3次。

1.2.2合成miR-146a干擾RNA miR-146a由上海吉瑪公司合成，序列為 5′-UGAGAACUGA A UUCCAU GGGUU-3′;N/C序列為5′-UUCUCCGAACGUGUC AC GU TT-3′。

1.2.3Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡 采用Hoechst染色試劑盒，將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，選擇對數(shù)生長期DU145/PC3 細(xì)胞，以無抗生素DMED/ F12培養(yǎng)基接種于6孔培養(yǎng)板中，用于轉(zhuǎn)染，將15 μl hsa-miR-146a/ NC mimics加入750 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基中，吹勻；將15 μl Lipofectamine 2000加入750 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基中，吹勻；5 min后，將兩管液體混勻，室溫放置30 min；將上述混合物加入6孔板中，搖勻。轉(zhuǎn)染72 h后，吸除舊培養(yǎng)基，實驗方法參見文獻[4]。

1.2.4構(gòu)建ROCK1 3′UTR報告基因質(zhì)粒 根據(jù)ROCK1基因在GenBank中的序列，運用引物設(shè)計專用軟件Primer5設(shè)計引物。上游引物: 5′-ACGCTCGAGGGCTTTGCAGTA ATGTGT ATCAG；下游引物: 5′-CTA GCGGCCGC GAGACGTTAT CTTTATT ATAC；酶切位點為NotⅠ、XhoⅠ。PCR擴增體系:DNA 1 μl，ddH2O 22 μl，PCR MIX 25 μl，上下游引物各1 μl，共計50 μl。擴增條件:95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后切膠，純化。酶切: ddH2O 3.2 μl，DNA/ psiCHECK-2載體5 μl，Buffer-Tango 1 μl，NotⅠ0.4 μl，XhoⅠ 0.4 μl，共計10 μl。37 ℃ 4～5 h。連接:DNA 5 μl，psiCHECK-2載體3 μl enovo，混勻后放置45 ℃ 5 min，冰浴3 min，加入T4連接酶1 μl和T4專用Buffer 1 μl，22 ℃過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑克隆，搖菌過夜，菌液測序，提質(zhì)粒備用。

1.2.5Luciferase實驗 選擇對數(shù)生長期DU145/PC3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d，以無抗生素DMED/F12培養(yǎng)基接種于24孔培養(yǎng)板中，用于共轉(zhuǎn)染，將750 ng Rho相關(guān)卷曲螺旋形成的蛋白激酶1(ROCK1)質(zhì)粒、6 μl hsa-miR-146a/ NC mimics加入150 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基中，吹勻；將6 μl Lipofectamine 2000加入另一 150 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基，吹勻；5 min后，將兩管液體混勻，室溫放置30 min；將上述混合物加入24孔板中，搖勻。轉(zhuǎn)染48 h后，按照Luciferase、ECL發(fā)光試劑盒說明書進行，每組重復(fù)3次。

1.2.6Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ROCK1、cleave-caspase 3蛋白表達 轉(zhuǎn)染方法見1.2.3。轉(zhuǎn)染72 h后裂解細(xì)胞，提取蛋白。采用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。SDS-PAGE電泳完成后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜， 加入ROCK1/cleave-caspase 3抗體(1∶500 )，4 ℃搖床過夜，HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，用ECL試劑于暗室中顯影并曝光。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理。組間比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Hoechst染色檢測miR-146a對DU145/PC3細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst染色結(jié)果(圖1)顯示，正常細(xì)胞核Hoechst染色的形態(tài)呈圓形，淡藍色，內(nèi)有較深的藍色顆粒；而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核由于濃集而呈亮藍色，或核呈分葉、碎片狀，邊集。說明miR-146a能夠明顯促進DU145/PC3細(xì)胞的凋亡。

圖1 Hoechst染色檢測miR-146a對DU145/PC3細(xì)胞凋亡的影響

2.2 Luciferase檢測miR-146a與其靶基因ROCK 1的結(jié)合

通過diana軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠與ROCK1的3′UTR直接結(jié)合(圖2A)。報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組與對照組相比熒光強度受到明顯抑制(P<0.05，圖2B)。

A.diana預(yù)測結(jié)合位點；B.統(tǒng)計結(jié)果

圖2 Luciferase顯示miR-146a與ROCK直接結(jié)合

2.3 Western blot檢測cleave-caspase 3 和ROCK1蛋白量的表達

轉(zhuǎn)染miR-146a后cleave-caspase 3 表達增加， ROCK1的表達降低(圖3)。

3 討 論

目前我國PCa的發(fā)病率呈上升趨勢，而且?guī)缀跛谢颊叩牟∽兌紝⒅饾u發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(Castration-refractory prostate cancer， CRPC)，目前對CRPC尚缺乏有效的治療藥物。因此，探討CRPC凋亡過程的分子機制，具有廣泛的應(yīng)用空間和前景。細(xì)胞生長周期中存在有增殖、分化和凋亡3個特性，其中細(xì)胞凋亡是機體細(xì)胞在生理或病理條件下發(fā)生的一種自發(fā)的程序化死亡過程，它的發(fā)生受體內(nèi)外多種因素的影響，涉及一系列相關(guān)基因的改變[5]。近年來miRNA成為研究熱點，到目前為止，有超過50個miRNAs被發(fā)現(xiàn)在PCa中異常表達[6-7]，通過實驗證實，miR-221/222、miR-21和miR-125b等有促癌基因功能，miR-101、miR-146a、miR-330，miR-34簇等有抑癌基因功能[8]。因此，與PCa凋亡有關(guān)的miRNA的作用機制尚需進一步明確。

圖3 Western blot檢測ROCK1、cleave-caspase 3蛋白的表達

研究發(fā)現(xiàn)，隨著PCa的進展，miR-146a的表達下降[9]，扮演抑癌基因的作用，可能是通過影響前列腺癌細(xì)胞的凋亡作用實現(xiàn)的。因此我們通過Hoechst染色方法檢測miR-146a對前列腺癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示miR-146a能夠促進DU145/PC3細(xì)胞的凋亡。研究表明miRNAs是非編碼RNA，主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。miRNA與靶mRNA的3′UTR端通過堿基互補配對的方式結(jié)合，通過誘導(dǎo)mRNA的降解與抑制翻譯來調(diào)控蛋白質(zhì)的表達[10]。因此miR-146a促進前列腺癌凋亡有可能是通過抑制其靶基因的表達來實現(xiàn)的。

ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族[11]，與細(xì)胞凋亡有關(guān)。ROCK 由ROCK 1和ROCK 2兩種異構(gòu)體構(gòu)成，它們均參與細(xì)胞凋亡過程[12]。ROCK 接受Rho傳遞的活化信號，發(fā)生多個氨基酸位點的磷酸化而激活，并介導(dǎo)下游一系列磷酸化/脫磷酸化反應(yīng)[13]，最終引起細(xì)胞狀態(tài)的改變。但是關(guān)于ROCK 1的異常表達是否會引起前列腺癌細(xì)胞凋亡尚未見報道。在本實驗中，我們通過Luciferase證實了ROCK 1是miR-146a的靶基因，然后通過Western blot驗證了miR-146a促進cleave-caspase 3的表達同時抑制了ROCK 1的表達。因此，下調(diào)ROCK 1的表達會引起前列腺癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-146a能夠通過抑制ROCK 1基因表達而促進CRPC細(xì)胞的凋亡，可以為今后PCa的治療提供新思路，但是其具體的作用途徑尚不明了，還需要進一步研究。

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miR-146a promotes the apoptosis of castration-resistant prostate cancer by inhibiting the expression of ROCK 1

JIANG Liang1，LIU Chun-hui1，XU Bin2，CHEN Ming2

(1.SchoolofMedicine，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China; 2.ZhongdaHospital，SoutheastUniversity，Nanjing210009，China)

Objective: To explore the affect and mechnism of miRNA-146a promoting the apoptosis of castration-resistant prostate cancer cells (DU145/PC3). Methods: Hoechst assay were performed to study the effect of high expression of miRNA-146a on apoptosis of prostate cancer cells. Western blot method were used to observe the high expression of miRNA-146a on expression of cleave-caspase 3. The ROCK1 3′UTR report gene plasmid was constructed and miRNA-146a minics was designed， followed by transferection into DU145 and PC3 cells respectively. The luciferase report gene detected the combination of miRNA-146a and its potential target genes ROCK1， Western blot was used to detect the amount of protein expression of ROCK1. Results: miRNA-146a promoted two kinds of prostate cancer cells DU145 and PC3 apoptosis. Cleave-caspase 3 expression was increased with high expression of miRNA-146a. The expression of ROCK1 was inhibited by combination of miRNA-146a with target gene ROCK1 3′UTR. Conclusion: miRNA-146a promotes the apoptosis of prostate cancer cells by inhibiting the expression of ROCK1.

prostate cancer; Rho-associated coiled-coil protein kinase 1; apoptosis

2014-12-01

2015-02-15

國家自然基金(81370849、81300472、81202034)、臨床醫(yī)學(xué)科技專項——新型臨床診療技術(shù)攻關(guān)基金(BL2013032)、教育部博士點基金(20120092120071)、江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012336)、南京市科技發(fā)展項目基金(201201053)、東南大學(xué)新教師基本科研項目基金(3290002402)資助項目

蔣亮(1989-)，男，山東棗莊人，在讀碩士研究生。E-mail:jiangliang135@163.com

陳明 E-mail:mingchenseu@126.com

蔣亮，劉春輝，許斌，等.miR-146a通過抑制ROCK 1基因的表達促進去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞的凋亡[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2015，34(3)：357-360.

R737.25

A

1671-6264(2015)03-0357-04

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.005