焦永亮，劉慧敏，2，顧海倫，李克雨，李星瑤，于曉璐，劉莉

(1.中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，遼寧 沈陽 110122；2.內蒙古自治區(qū) 地方病防治中心，內蒙古 呼和浩特 010030；3.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 骨科，遼寧 沈陽 110004)

·論 著·

白藜蘆醇對肥胖者骨性關節(jié)炎軟骨細胞的作用及對TLR4、NF-κBmRNA表達的影響

焦永亮1，劉慧敏1，2，顧海倫3，李克雨1，李星瑤1，于曉璐1，劉莉1

(1.中國醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，遼寧 沈陽 110122；2.內蒙古自治區(qū) 地方病防治中心，內蒙古 呼和浩特 010030；3.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 骨科，遼寧 沈陽 110004)

目的:探討白藜蘆醇是否可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗骨性關節(jié)炎的作用。方法:采用兩步酶消化法分離培養(yǎng)肥胖者骨性關節(jié)炎軟骨細胞。免疫細胞化學染色及甲苯胺藍染色對細胞進行表型鑒定。應用MTT法測定白藜蘆醇對軟骨細胞增殖活力的影響。ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基上清TNF-α的水平。RT-PCR法檢測TLR4、NF-κBmRNA表達水平。結果:軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色及蛋白多糖甲苯胺藍染色呈陽性。白藜蘆醇濃度在6.25～100 μmol·L-1時對細胞增殖均無抑制作用，其中低濃度的白藜蘆醇(6.25～12.5 μmol·L-1)能促進細胞增殖(P<0.05)。IL-1β(10 ng·ml-1)能抑制細胞增殖(P<0.05)。白藜蘆醇濃度在6.25～12.5 μmol·L-1時，對IL-1β誘導的細胞活力降低有顯著抑制作用。相比對照組，IL-1β誘導組的培養(yǎng)基上清中TNF-α水平及軟骨細胞TLR4、NF-κBmRNA表達均明顯增加(P<0.01)，而加入白藜蘆醇(6.25～12.5μmol·L-1)處理后，TNF-α水平及TLR4、NF-κBmRNA表達均顯著降低(P<0.01)。結論:白藜蘆醇可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗骨性關節(jié)炎效應。

軟骨細胞；白藜蘆醇；Toll樣受體4；骨性關節(jié)炎；肥胖

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種退行性關節(jié)病變，臨床主要表現為進行性關節(jié)疼痛、僵硬、功能障礙。目前肥胖在全球范圍內的急劇增加已經成為OA增加的重要原因之一[1]。肥胖時游離脂肪酸增多，激活巨噬細胞和脂肪細胞表面的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)[2]，從而誘發(fā)細胞內炎性信號通路，促使炎癥因子白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及單核細胞趨化蛋白等的釋放，造成局部和全身慢性炎癥[3-4]。研究顯示，白藜蘆醇(resveratrol，RES)可以通過抑制凋亡、抗炎和抗氧化作用發(fā)揮抗OA效應。其中，RES發(fā)揮抗炎作用的中心環(huán)節(jié)是通過抑制核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的活化，進而下調促炎癥因子的表達而實現的[3-6]。因此，本研究選擇肥胖OA患者的膝、髖關節(jié)軟骨細胞進行體外培養(yǎng)，首先觀察RES對退變的肥胖者炎癥軟骨細胞的作用；然后通過檢測TLR4、NF-κBmRNA的表達，探討其是否通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗OA的作用。

1 材料與方法

1.1 軟骨組織來源

經中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者知情同意后獲取20例因OA而行膝、髖關節(jié)置換的患者關節(jié)軟骨組織(男10例，女10例)?；颊吣挲g48～70歲，BMI指數大于28。

1.2 主要儀器和試劑

MultiskanMK3酶標儀(美國Thermo公司)，7500 Real-Time PCR儀(美國ABI公司)。IL-1β(美國PeproTech)，RES、DMSO和MTT(美國Sigma)，DMEM-F12(美國Hyclone)，Ⅱ型膠原一抗(武漢博士德)，SP試劑盒(北京中杉金橋)，Trizol 和RT-PCR試劑盒(大連寶生物)，ELISA試劑盒(武漢博士德)。

1.3 方法

1.3.1軟骨細胞的分離及培養(yǎng) 提取關節(jié)軟骨組織中軟骨細胞進行原代細胞培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分數為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h更換培養(yǎng)基。待軟骨細胞貼壁達到80%～90%后傳代。傳代細胞用含10%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，傳至第3代使用。

1.3.2軟骨細胞表型鑒定 Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色方法:軟骨細胞爬片、固定后，按SP試劑盒說明書操作。蛋白多糖甲苯胺藍染色方法:軟骨細胞爬片、固定，1%甲苯胺藍染色30 min，無水乙醇脫水，鏡下觀察。

1.3.3MTT法檢測RES對細胞活性的影響 第2代關節(jié)軟骨細胞消化后，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl(103～104個細胞)。細胞分組:對照組、溶劑對照組(0.1%DMSO)、RES處理組(濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)、IL-1β組(IL-1β+0.1%DMSO)、IL-1β+RES處理組(RES濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)，IL-1β的終濃度是10 ng·ml-1。細胞處理24 h后，按MTT試劑盒說明書操作。

1.3.4細胞處理 第2代關節(jié)軟骨細胞消化后接種于6孔板中，待細胞融合至80%～90%后，換用0.5%FBS的培養(yǎng)液，細胞加10 ng·ml-1IL-1β預先孵育1 h后再加RES處理，分組如下:對照組(0.1%DMSO)、IL-1β組(IL-1β+0.1%DMSO)、IL-1β+RES處理組(RES濃度6.25、12.5、25、50、100 μmol·L-1)，每組設3個復孔，24 h后收集細胞及培養(yǎng)基上清。

1.3.5培養(yǎng)基上清TNF-α水平的測定 采用ELISA法，按試劑盒說明書操作。

1.3.6RT-PCR檢測TLR4、NF-κBmRNA表達 采用RT-PCR檢測，按試劑盒說明書操作。數據分析:β-actin作為內參基因，數據分析采用2-ΔΔCt分析法。β-actin引物序列(101 bp):上游5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游5′-CTCAGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT-3′；TLR4引物序列(148 bp):上游5′-AGGACTGGGTAAGGAATGAGC-3′，下游5′-ATCACCTTTCGGCTTTTATGG-3′；NF-κB引物序列(218 bp):上游5′-AGGAGAGGATGAAGGAGTTGTG-3′，下游5′-CCAGAGTAGCCCAGTTTTTGTC-3′。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 軟骨細胞鑒定

如圖1所示，Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色，軟骨細胞胞漿均呈棕黃色；蛋白多糖甲苯胺藍染色可見細胞呈藍紫色。

A.免疫細胞化學染色×200；B.甲苯胺藍染色×200

圖1 第3代軟骨細胞

2.2 不同濃度RES對肥胖者軟骨細胞活性的影響見圖2。

與溶劑對照組比較，aP<0.05；與IL-1β組比較，bP<0.05

圖2 不同濃度RES對肥胖者OA軟骨細胞活性的影響

由圖2可見，溶劑對照組與對照組相比，細胞活力無明顯差異(P>0.05)。RES濃度范圍在6.25～12.5 μmol·L-1時可以促進細胞增殖(P<0.05)；RES濃度范圍在25～100 μmol·L-1時，對細胞增殖無明顯影響(P>0.05)。當用IL-1β預先孵育軟骨細胞1 h后，細胞活力明顯降低(P<0.05)；而加入RES后，在6.25～12.5 μmol·L-1濃度時，可以顯著抑制IL-1β誘導的細胞活力降低(P<0.05)。

2.3 不同濃度RES對IL-1β誘導的肥胖者OA軟骨細胞分泌TNF-α水平的影響

見圖3。

由圖3可見，加入IL-1β誘導后，培養(yǎng)基上清中TNF-α水平明顯增加(P<0.01)；相比IL-1β組，不同濃度RES(6.25～100 μmol·L-1)處理后，TNF-α水平均顯著下降(P<0.01)。

2.4 不同濃度RES對IL-1β誘導的肥胖者OA軟骨細胞TLR4mRNA表達的影響見圖4。

由圖4可知，加入IL-1β誘導后，軟骨細胞TLR4mRNA表達明顯增加(P<0.01)；相比IL-1β組，不同濃度RES(6.25～100 μmol·L-1)處理后，TLR4mRNA均顯著下降(P<0.01)。

與對照組比較，aP<0.01；與IL-1β組比較，bP<0.01

圖3 不同濃度RES對IL-1β誘導的肥胖者OA軟骨細胞分泌TNF-α水平的影響

與對照組比較，aP<0.01;與IL-1β組比較，bP<0.01

圖4 不同濃度RES對IL-1β誘導的肥胖者OA軟骨細胞TLR4mRNA表達的影響

2.5 不同濃度RES對IL-1β誘導的肥胖者OA軟骨細胞NF-κBmRNA表達的影響

見圖5。

與對照組比較，aP<0.01；與IL-1β組比較，bP<0.01

圖5 不同濃度RES對IL-1β誘導的肥胖者OA軟骨細胞NF-κBmRNA表達的影響。

由圖5可知，加入IL-1β誘導后NF-κBmRNA表達增加了80%(P<0.01)，相比IL-1β組，不同濃度RES(6.25～100 μmol·L-1)處理后，NF-κBmRNA表達均降低(P<0.01)。

3 討 論

軟骨組織由軟骨細胞、基質及膠原纖維構成。軟骨細胞是軟骨組織的唯一細胞成分，軟骨細胞可以產生大量Ⅱ型膠原和蛋白多糖。其中Ⅱ型膠原主要存在于軟骨，而蛋白多糖呈酸性，可被堿性染料甲苯胺藍染成藍紫色。本實驗結果顯示:經Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色，培養(yǎng)的軟骨細胞胞漿呈棕黃色；甲苯胺藍染色細胞呈藍紫色，軟骨細胞內及細胞周圍有藍紫色異染顆粒。證實了本實驗所培養(yǎng)的細胞為軟骨細胞。

IL-1β為多肽類物質，目前已作為建立體外OA模型的誘導劑而廣泛使用。本實驗加入10 ng·ml-1IL-1β預先孵育軟骨細胞1 h，誘導OA。RES屬非黃酮類多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等作用。本實驗通過MTT法確定RES對軟骨細胞無抑制作用的濃度。我們實驗結果表明，0.1%DMSO和RES(6.25～100 μmol·L-1)對細胞增殖均無抑制作用，其中低濃度的RES(6.25～12.5 μmol·L-1)能促進細胞增殖。Csaki等[7]研究顯示，RES濃度在50 μmol·L-1時能促進人軟骨細胞的增殖。本實驗結果與Csaki等研究結果存在差異，可能原因是Csaki等實驗細胞提取自正常人的關節(jié)，而本實驗細胞來自肥胖OA患者，細胞本身已發(fā)生退變，退變的OA細胞對RES較敏感，即低劑量的RES就能增強細胞活力。當用IL-1β預先孵育軟骨細胞1 h后，細胞活力明顯降低，提示10 ng·ml-1IL-1β對細胞增殖有抑制作用。

TNF-α是一種多功能的炎癥細胞因子，對關節(jié)軟骨具有一定的破壞作用。研究發(fā)現，TNF-α不僅能誘導其他細胞因子如IL-1、單核粒細胞刺激因子的產生，加重炎癥反應[8]，還能誘導基質金屬蛋白酶的表達，導致關節(jié)軟骨的損傷[9]。在一項對心肌細胞缺氧/復氧損傷的研究中發(fā)現，RES濃度在5 μmol·L-1時就能抑制TNF-α[10]。本實驗研究結果顯示，10 ng·ml-1IL-1β能明顯刺激人關節(jié)軟骨細胞分泌TNF-α，提示該濃度的IL-1β作為OA體外模型誘導劑可以發(fā)揮促炎癥作用；加RES后TNF-α均下降，說明RES抑制了IL-1β誘導的OA軟骨細胞分泌TNF-α，提示RES具有抗OA效應。

TLR4是一類跨膜受體，可通過識別病原相關分子模式激活信號轉導途徑，誘導炎癥細胞因子表達，引發(fā)炎癥反應。Schelbergen等[11]研究發(fā)現，OA患者軟骨細胞TLR4mRNA的表達高于非OA患者，且鈣結合蛋白S100A8及其伴侶S100A9可通過TLR4來影響OA患者軟骨細胞的分解代謝，表明TLR4在OA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。NF-κB在TLR4信號通路下游處于中心位置。NF-κB被激活后進入細胞核內，與相應靶序列結合，調節(jié)炎癥因子如TNF-α、IL-6等的表達[12]。研究發(fā)現，NF-κB信號通路的激活能促進基質金屬蛋白酶基因及蛋白表達，導致細胞外基質損傷和關節(jié)軟骨降解[13]。本研究結果顯示:經IL-1β誘導后TLR4、NF-κBmRNA表達均顯著升高，提示OA時軟骨細胞的TLR4/NF-κB信號通路可能被激活；軟骨細胞經RES處理后，TLR4、NF-κBmRNA均顯著降低，提示RES可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗OA作用，且隨著RES濃度的增加，這種抗OA的作用也越顯著。

綜上所述，我們的研究結果初步提示在肥胖OA關節(jié)軟骨細胞中，RES可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗OA效應。但是，本實驗只檢測了mRNA的表達，將來的研究要通過對蛋白表達進行檢測，以及通過小RNA干擾研究進一步證實該通路的存在。

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Effect of resveratrol on chondrocytes from obese osteoarthritic patients and the expression of TLR4 and NF-κB mRNA

JIAO Yong-liang1，LIU Hui-min1，2，GU Hai-lun3，LI Ke-yu1，LI Xing-yao1，YU Xiao-lu1，LIU Li1

(1.DepartmentofNutritionandFoodHygiene，SchoolofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China; 2.NeimengguCenter,EndemicDiseaseControl，Huhehaote010030，China; 3.DepartmentofOrthopedics，ShengjingHospital，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110004，China)

Objective: To investigate whether resveratrol can exert anti-osteoarthritic effect via the TLR4/NF-κB signaling pathway. Methods: Human articular chondrocytes were isolated and cultured by two-step eny matic digestion. The chondrocytes were identified by immunocytochemistry staining and toluidine blue staining. The cell viability was determined by the MTT assay. The levels of TNF-αin cell culture supernatant were measured by ELISA. The expression of TLR4 and NF-κB mRNA were examined by RT-PCR. Results: Cultured chondrocytes presented positive cells by Type Ⅱ collagen immunocytochemistry staining and toluidine blue staining. MTT assay showed that resveratrol (6.25-100 μmol·L-1) had no discernable inhibition effects on chondrocytes cultured in the presence or absence of IL-1β. At 6.25 and 12.5 μmol·L-1， resveratrol significantly stimulated chondrocyte proliferation. In addition， viability of cells exposed to IL-1β(10 ng·ml-1) was significantly impaired but not in the presence of resveratrol (6.25-12.5 μmol·L-1) (P<0.05). The level of TNF-αand the expression of TLR4 and NF-κB mRNA were significantly upregulated in the presence of IL-1β(10 ng·ml-1) (P<0.01) compared with control group， while resveratrol (6.25-100 μmol·L-1) treatment could dramatically downregulate TNF-αlevels and TLR4 and NF-κB mRNA expression (P<0.01). Conclusion: The anti-inflammatory effect of resveratrol on human articular chondrocyte may at least partly via the inhibition of the TLR4/NF-κB signaling pathway.

chondrocytes; resveratrol; toll-like receptor 4; osteoarthritis; obesity

2014-12-25

2015-02-10

國家自然科學基金(81372971)、遼寧省自然科學基金(201202267)資助項目

焦永亮(1988-)，男，滿族，吉林梅河口人，在讀碩士研究生。E-mail:jiaoyongliang075@163.com

劉莉 E-mail:liuli@mail.cmu.edu.cn

焦永亮，劉慧敏，顧海倫，等.白藜蘆醇對肥胖者骨性關節(jié)炎軟骨細胞的作用及對TLR4、NF-κBmRNA表達的影響[J].東南大學學報:醫(yī)學版，2015，34(3)：342-346.

R151.2

A

1671-6264(2015)03-0342-05

10.3969/j.issn.1671-6264.2015.03.002