雷震　魏晉寶　楊光義　錢秋霞　葉方　張晨寧　雷攀

盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的含量測定與提取方法研究

雷震魏晉寶楊光義錢秋霞葉方張晨寧雷攀

【關(guān)鍵詞】盾葉薯蕷;薯蕷皂苷元;含量測定;提取方法;研究概述

【中圖分類號】R 195

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2015)17－2671－05

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.17.040

項目來源:湖北省科學技術(shù)研究與發(fā)展支撐計劃(對外科技合作類)項目(編號: 2013BHE017)

作者單位: 442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院(雷震、魏晉寶、楊光義、葉方、張晨寧);湖北醫(yī)藥學院藥學院(錢秋霞);湖北中醫(yī)藥大學(雷攀)

通訊作者:楊光義，442000湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學院附屬十堰市太和醫(yī)院;

E-mail: ygy996@163.com

盾葉薯蕷又名黃姜、火頭根，分類學上隸屬于單子葉植物百合目、薯蕷科、薯蕷屬，根狀莖組，多年生纏繞草質(zhì)藤本植物［1］。盾葉薯蕷是我國特有的藥用植物，廣泛分布于我國的湖北、陜西、河南、湖南等地，尤其是湖北和陜西兩省的種植面積最大，占到全國的70%［2］。從盾葉薯蕷中提取的皂苷元是生產(chǎn)甾體類激素和甾體類避孕藥的工業(yè)原料，世界上約2/3的甾體激素藥物是以薯蕷皂苷元作為基礎(chǔ)原料來合成的，因此，薯蕷皂苷元在甾體激素類藥物生產(chǎn)中具有十分重要的地位［3］。研究發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷及其衍生物具有抗病毒、抗腫瘤、改善血管內(nèi)皮細胞功能、抗炎、降血脂、抗艾滋病等藥理作用［4－8］。目前，在工業(yè)上常用酸水解法來提取盾葉薯蕷中的皂苷元，這不僅會對環(huán)境造成嚴重的污染，且提取效率較低。所以，開發(fā)潔凈的皂苷元提取工藝是保護環(huán)境的迫切需要，而皂苷元的含量測定方法是工藝開發(fā)、優(yōu)選及改進的重要評價指標。本文將對盾葉薯蕷中皂苷元的傳統(tǒng)及新開發(fā)的提取工藝及含量測定方法進行總結(jié)，以期對盾葉薯蕷中皂苷元的生產(chǎn)工藝改進、質(zhì)量標準制定及質(zhì)量控制提供參考文獻。

1　薯蕷皂苷元含量測定方法

薯蕷皂苷元的測定方法是評價工藝條件和提取方法、品種優(yōu)選、藥效比較的一種重要工具。薯蕷皂苷元的測定方法有重量法和薄層掃描法等方法，后來發(fā)展的分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法，以及應用較新的酶聯(lián)免疫吸附法等方法，它們在含量測定中有各自的特點，在具體的運用中要根據(jù)實際情況針對每種方法的優(yōu)缺點進行選擇。

1.1重量法重量檢測法由于其操作直觀，易于掌握，從20世紀50年代末一直沿用至今。重量法有兩種方法:(1)先經(jīng)多次重結(jié)晶合并結(jié)晶后再稱取總重量計算植物中的薯蕷皂苷元［9］;(2)先用石油醚提取皂苷元，將其濃縮干燥至恒重后，稱得濃縮物和瓶的總重(G1)，再將薯蕷皂素溶于乙醇，將瓶洗干凈后烘干至恒重，稱得瓶重(G2)，兩者之差就是薯蕷皂苷元的重量。重量法原理簡單，設備要求不高，只需稱重即可，但測定誤差大，在工廠中主要用于粗略分析。

1.2薄層色譜法(TLC)TLC法是將一定波長的單色光垂直照射展開后的薄層板，測定薄層色譜斑點的吸收度隨展開距離的變化，所得關(guān)系曲線下的面積與色譜斑點的中待測物質(zhì)的濃度或量成正比，這種定量分析方法稱為薄層掃描法［10］。王菊鳳等［11］采用TLC法和RP-HPLC法對在生長光強為1.5、10、30、55、100、270 μmol·m－2·s－1下的弱光生態(tài)型盾葉薯蕷的薯蕷皂苷元和生物量分別進行測定，以探討不同光強與盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元和生物量的關(guān)系，并找出弱光生態(tài)型盾葉薯蕷的最適生長光強，并得出結(jié)論，弱光型盾葉薯蕷是一種薯蕷皂苷元量較高的薯蕷變種，這將為該藥源植物的選擇育種以及栽培提供理論指導。TLC可同時對多種復雜的樣品進行分離和測定，簡便快速、專屬性好，但測量誤差較大，一般多用于定性檢測。

1.3分光光度法分光光度法是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。薯蕷皂苷元與顯色劑作用而形成共軛，導致最大吸收波長紅移至530 nm處，而其他甾體皂苷元無此結(jié)構(gòu)，從而得以分離測定。陳戰(zhàn)國等［12］采用此法對盾葉薯蕷中的薯蕷皂苷元含量進行測定。王雷［13］也用此法測量了酸解溶液中薯蕷皂苷元的含量。分光光度法具有操作簡單、消耗費用低等優(yōu)點，并且皂苷元提取后不需分離精制即可直接測定在一定程度上具有專屬性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，與高效液相色譜法(HPLC法)相比，分光光度計法不需要中和溶液，測量速度快、試驗成本低，但實驗步驟繁瑣。

1.4 HPLC法HPLC以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的定量及定性分析。謝彩霞等［14］通過RP-HPLC法測定薯蕷皂苷元的含量，并對含水量、生長年限、產(chǎn)地及土壤類型與薯蕷皂苷元含量的相關(guān)性進行研究，確定了影響盾葉薯蕷中有效成分含量的因素，以更好地控制其質(zhì)量。葛芝紅［15］采用HPLC法進行定量檢測的研究，對盾葉冠心寧片質(zhì)量標準進行了以薯蕷皂苷元為指標成分的含量測定方法研究，建立了增加盾葉冠心寧片含量測定方法的新質(zhì)量標準。HPLC法與氣相色譜法相比，使用范圍廣，流動相選擇性大，層析柱使用壽命長，流出組分易收集，樣品凈化預處理過程簡單，可同時分離測定多種物質(zhì)。

1.5氣相色譜法(GC)GC是利用物質(zhì)的沸點、極性及吸附性質(zhì)的差異來實現(xiàn)混合物的分離。都述虎等［16］應用毛細管GC測定了薯蕷總皂苷中薯蕷皂苷元的含量，該法與HPLC相比，樣品無須衍生化，分離效果好，且對薯蕷總皂苷中薯蕷皂苷元的含量測定方法進行了有益的探索。GC法對于組分多的混合物，既可分離又能提供定量數(shù)據(jù)，迅速方便，精密度好，此法比較適于中藥及中成藥中揮發(fā)性復雜成分分析［17］。

1.6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗是一種固相免疫測定技術(shù)，其先將抗體或抗原包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性，讓抗體與酶復合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測，且顏色的深淺可作為判定抗原含量的依據(jù)［18］。ELISA法最早是由Engvall 在1971年用堿性磷酸脂酶標記的的gIC。隨后該法得到了不斷地完善。后來經(jīng)過不斷的發(fā)展，該法被首次應用于薯蕷皂苷元的含量測定中［18］。ELISA靈敏度很高，是HPLC的幾百倍，檢測所需的樣品量少，效率高，處理量大，尤其適用薯蕷皂苷元等甾體激素類物質(zhì)的檢測。但是該法仍然有一些不足，如制作手續(xù)相對復雜，保存期較短，市場上沒有檢測薯蕷皂苷元試劑盒。

2　薯蕷皂苷元提取方法

薯蕷皂苷元是異螺旋甾烷的衍生物，能溶于甲醇、石油醚、環(huán)己烷等有機溶劑。在植物體內(nèi)與糖鏈或纖維素結(jié)合形成苷鍵，并與細胞壁緊密結(jié)合。由于細胞壁比較堅韌，很難從植物原料中徹底分離提取出薯蕷皂苷元，要提取皂苷元首先要將薯蕷皂苷與細胞壁分離，然后再斷開苷鍵使皂苷元游離出來，最后再進行提取。目前常用的提取工藝有直接酸解法、酶解法、生物轉(zhuǎn)化法、超臨界流體萃取法、超聲提取法、熱壓分解法、微波萃取法、分離法等。

2.1直接酸解法直接酸水解法是在盾葉薯蕷根莖的粗粉中加入稀酸(稀硫酸或稀鹽酸)進行水解，斷開苷鍵使薯蕷皂苷元變成游離態(tài)，然后用提取劑將薯蕷皂苷元從酸解后的盾葉薯蕷中提取出來。宋子言等［19］采用硫酸水解-溶劑提取的方法得到皂苷元。酸解法雖然簡單但是存在諸多缺點:當用鹽酸水解時常常會產(chǎn)生羥基氯代反應;在酸性條件下薯蕷皂苷元易脫水發(fā)生轉(zhuǎn)換;盾葉薯蕷根莖堅硬含有大量的淀粉和纖維素，薯蕷皂苷水解的不徹底造成皂苷元收率降低，浪費了大量的原料;酸水解后經(jīng)大量水沖洗過程中產(chǎn)生大量廢液污染環(huán)境;酸水解的過程劇烈破壞了薯蕷中的淀粉和糖，不利于資源綜合利用;生產(chǎn)過程中選擇汽油作為提取溶劑，其為易燃易爆物品為提取帶來一定危險。

2.2酶解法

2.2.1直接酶解法:直接酶解法是利用從植物或微生物中得到的相關(guān)酶催化水解天然底物從而得到目標產(chǎn)物的方法。周振起等［20］用糖化酶和液體曲酶作用于盾葉薯蕷的根莖使薯蕷皂苷元與糖(纖維素)連接的皂苷鍵斷裂，促進薯蕷皂苷元的游離，皂苷元的得率達到4%。王亞南等［21］比較了細菌發(fā)酵法、真菌發(fā)酵法和酶解法三種轉(zhuǎn)化薯蕷皂苷成為皂苷元的方法，發(fā)現(xiàn)其中用直接酶解法進行酶反應定向轉(zhuǎn)化的效果最佳，轉(zhuǎn)化效率高達95%。直接酶解法操作簡單、效率好且避免了傳統(tǒng)酸水解造成的環(huán)境污染問題，但由于成本昂貴，很難應用于工業(yè)化生產(chǎn)。

2.2.2梯度生物酶解法:梯度生物酶解法就是在酸水解之前依次加入纖維素酶和果膠酶復合酶制劑、淀粉酶、以及糖化酶等來對盾葉薯蕷進行處理的技術(shù)。薯蕷皂苷元在植物體內(nèi)與纖維素等結(jié)合存在于細胞壁上，細胞壁比較堅硬不利于皂苷元的溶出，用酶處理后可以溫和的將“束縛”慢慢解除，有利于皂苷元的提取。張裕卿等在盾葉薯蕷粉末中依次加入纖維素酶和果膠酶復合酶制劑、淀粉酶以及糖化酶先進行酶催化反應，然后加入H2SO4水解，最后用索氏回流提取得到皂苷元。該研究結(jié)果表明梯度生物酶解法所得皂苷元的收率為2.79%，并能將植物中98%的薯蕷皂苷元提取出來［22］。酶處理可以減小藥材包裹薯蕷皂苷的屏蔽作用，降低其空間位阻，減少酸用量，能夠最大限度的將薯蕷皂苷水解成皂苷元，提高收率，但是仍然無法避免酸水解帶來的環(huán)境污染問題。

2.2.3復合酶解法:復合酶解法是在酸水解之前，在盾葉薯蕷粉末中加入酶的復合制劑來對盾葉薯蕷進行預處理，從而減小淀粉、纖維素、糖類等物質(zhì)對盾葉薯

蕷中皂苷元的提取造成的阻礙的方法。羅娜［23］用復合酶解法提取皂苷元并得出其最優(yōu)條件:酶解時間16 h，酶解溫度35℃，酶解pH值為5.0，酶用量40 U/g時，且與直接酸解法、自然發(fā)酵法比較得出復合酶解法皂苷元收率明顯提高。劉國際等［24］比較了復合酶法、纖維素酶法、淀粉酶法、糖化酶法的提取效果，研究結(jié)果表明纖維素酶法提取出的皂苷元純度最高，復合酶法提取的皂苷元收率最高。徐升運等［25］采用淀粉-纖維素復合酶法提取盾葉薯蕷皂苷元，薯蕷皂苷元收率提高26%。復合酶解法具有污水排放減少、皂苷元得率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，是一項清潔生產(chǎn)工藝，具有較好應用前景。

2.3微生物轉(zhuǎn)化法

2.3.1預發(fā)酵法:預發(fā)酵法又叫自然發(fā)酵法，是先在自然條件下利用植物體本身和環(huán)境中的微生物代謝產(chǎn)生的胞外酶來使苷鍵斷裂，淀粉、纖維素等部分水解，植物疏松，再進行酸水解提取薯蕷皂苷元的方法。該方法不需要接入菌種，同時不僅顯著提高了皂苷元的收率，還縮短了水解時間。20世紀80年代，四川生物研究所薯蕷綜合利用組的研究人員通過實驗也證明了這一點［26］，在常規(guī)的酸水解之前進行原料自然發(fā)酵處理，穿龍薯蕷的收率能提高54%，盾葉薯蕷的收率可以提高40%。雖然預發(fā)酵法可以提高盾葉薯蕷的收率，但是該方法在工藝過程中仍存在諸多問題:多種微生物共同發(fā)酵，體系內(nèi)內(nèi)酶種類復雜隨著發(fā)酵時間的延長，雜質(zhì)的含量會增多，產(chǎn)品熔點降低從而影響提取的效果;隨季節(jié)環(huán)境等的變化，酶反應條件不好控制，會造成產(chǎn)物質(zhì)量和收率的差異;工藝過程中的廢水的產(chǎn)量并沒有降低，對環(huán)境的危害仍然存在;淀粉、糖等物質(zhì)還是沒有得到綜合利用。

2.3.2微生物直接轉(zhuǎn)化法:微生物直接轉(zhuǎn)化法就是先選擇可以將盾葉薯蕷中的薯蕷皂苷直接轉(zhuǎn)化為皂苷元的微生物直接接種于原料中，進行培養(yǎng)和發(fā)酵，最后得到薯蕷皂苷元的工藝。早在2008年，已有相關(guān)研究人員采用微生物發(fā)酵的方法來獲得盾葉薯蕷中的皂苷元［27］。董悅生等［28］利用米曲霉進行微生物直接轉(zhuǎn)化，薯蕷皂苷元得率可達17.06 mg/g，是粗酶液轉(zhuǎn)化的6.77倍，該工藝轉(zhuǎn)化過程中甾體的總摩爾數(shù)是微波輔助提取和酸水解的1～2倍。該工藝中微生物產(chǎn)生的酶具有一定的專一性，有利于有效成分的溶出，成本較低，發(fā)酵工藝成熟便于工業(yè)化生產(chǎn)，摒棄了酸水解過程帶來的環(huán)境污染問題，是一項潔凈的生產(chǎn)工藝。

2.4超臨界流體萃取法超臨界流體萃取法是近些年新興的提取方法之一，是將超臨界流體作為萃取劑將一種物質(zhì)從混合物中提取出來的方法，通過超臨界流體的溶解能力與其密度的關(guān)系進行提取分離，因CO2臨界點低、無毒、不易揮發(fā)、化學性質(zhì)穩(wěn)定、容易從萃取體系中除去，所以CO2是常用的萃取劑。李水清等［29］用超臨界CO2萃取盾葉薯蕷酸解后粗品中的薯蕷皂苷元，過程中以乙醇作夾帶劑，萃取壓力30 MPa，萃取溫度50℃，萃取時間2 h，皂素提取率為89.4%，而一般索式回流提取法的皂素提取率為77.2%。王鳳芝等［30］對比了常規(guī)酸水解法和先酸解后超臨界CO2萃取法的不同，發(fā)現(xiàn)常規(guī)酸水解法薯蕷皂苷元的得率為0.622%，而超臨界CO2萃取后薯蕷皂苷元的得率可達1.226%。超臨界流體萃取系統(tǒng)具有較快的傳質(zhì)和萃取速度，與傳統(tǒng)的中藥提取分離技術(shù)相比超臨界流體萃取法具有工藝簡單，皂苷元收率高，提取周期短，萃取技術(shù)具有對原料成分無破壞，避免了易燃易爆有機溶劑汽油等優(yōu)點。但超臨界流體萃取萃取僅僅是從水解物到薯蕷皂苷元的提取過程中生產(chǎn)工藝的改革，需要在高壓的條件下進行，對設備要求高投資費用大，產(chǎn)量不穩(wěn)定，沒有對盾葉薯蕷綜合利用。因此，該法并沒有普遍應用于工業(yè)生產(chǎn)。

2.5超聲提取法超聲提取法是利用超聲波的強振動、強攪拌作用和強空化效應，來加速中藥材中目標成分的溶出并充分與溶劑混合常用于超聲波輔助酸解法和直接超聲法提取皂苷元。郭錦明等［31］探討在95%乙醇溶液中，采用超聲法直接提取盾葉薯蕷皂苷元，不再進行酸解。結(jié)果顯示，功率為300 kHz、提取時間為30 min最適宜;皂苷元提取率較一般回流法明顯提高，提取時間顯著縮短。張黎明等［32］將10 g盾葉薯蕷粗粉，于固液比為1∶10(g∶ml)的70%乙醇溶液中，在功率100 W條件下超聲提取2次，每次30 min，再進行酸解，薯蕷皂苷元得率2.570%，發(fā)現(xiàn)超聲處理對盾葉薯蕷中薯蕷皂苷元的溶出，以及對薯蕷總皂苷的苷鍵裂解都有顯著效果。與常規(guī)的各種酸解法相比，超聲波輔助酸解法先對原料進行超聲處理，破壞原料細胞組織結(jié)構(gòu)，再進行酸解，具有得率高、時間短、能耗低等優(yōu)點，但是仍然會對環(huán)境造成污染，也不利于資源綜合利用。然而，直接超聲提取法可以直接斷裂皂苷鍵，過程中避免了酸的使用，可以解決環(huán)境污染的問題。

2.6熱壓分解法熱壓分解法是由劉國際等［33］首次提出并申請了國家專利。該工藝是在高溫高壓條件下使薯蕷皂苷元與糖之間的苷鍵斷裂，游離出皂苷元，其工藝流程為:將盾葉薯蕷粗碎成小塊置于飽和蒸汽壓下充分處理，然后將物料進行干燥、粗碎，再用石油醚進行提取得到皂苷元。陳俊英等［34］研究了影響熱分

解的各種影響因素，結(jié)果表明在飽和蒸汽壓力1.4 MPa，保壓時間30 min，加料量為負載的85%的條件下薯蕷皂素的收率為1.745%。該工藝與傳統(tǒng)方法比較，二者萃取率相當，但傳統(tǒng)酸解法生產(chǎn)時產(chǎn)生大量的廢液對環(huán)境造成嚴重的污染，而熱壓分解法則省去了酸解過程，完全避免了酸水帶來的環(huán)境污染問題，且生產(chǎn)周期短、耗能低，是一種具有廣闊應用前景的清潔工藝。

2.7分離法分離法是根據(jù)淀粉和纖維素難溶于水，而薯蕷皂苷可溶于水的性質(zhì)將薯蕷根莖帶水磨碎、過慮、分離出纖維渣，靜置沉淀分離淀粉后，再提取皂苷元的方法。劉國梁等［35］對盾葉薯蕷進行了分離處理，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元僅存在于懸濁液部分。陳合等［36］通過對酶解-酸水解法、預發(fā)酵-酸水解法、分離-發(fā)酵-酸水解法、分離-酸水解法等提取皂苷元的工藝進行比較，發(fā)現(xiàn)分離法皂苷元的平均得率為傳統(tǒng)方法的86.56%，但用酸量僅為傳統(tǒng)方法的9.62%，同時分離得到46.44%的纖維素和32.75%的淀粉，有效實現(xiàn)了資源綜合利用。分離法能預先除去纖維素和淀粉以節(jié)省化工原料、動力和勞力，同時綜合利用纖維素和淀粉，但工藝流程長，生產(chǎn)中需耗費大量的水，且該工藝對設備要求較高，投資過大，在工業(yè)生產(chǎn)中限制了其廣泛應用。

2.8微波萃取法微波萃取法是將微波的能量傳遞到溶劑及細胞中，細胞內(nèi)部升溫，壓力變大，細胞壁破裂，皂苷元流出。李謙等［37］對比了微波和水浴兩種不同的加熱方法下盾葉薯蕷皂苷元的水解效率，其中微波法水解的時間為水浴的8%，鹽酸用量減少50%，皂苷元的得率提升20%。劉琳等［38］比較了回流、冷浸漬、索氏提取和微波輔助雙水相提取4種方法的提取效果，結(jié)果表明微波輔助法提取皂苷元的提取率僅次于索氏提取法。舒明勇［39］采用微波萃取法提取薯蕷皂苷元，實驗發(fā)現(xiàn)當提取條件是固液比1∶20，提取時間10 min，提取溫度100℃，粒度60目時，經(jīng)高效液相色譜法檢測得率可達1.837%。微波萃取法選擇性高、提取時間短、提高了薯蕷總皂苷的溶出率及有效成分的得率。

薯蕷皂苷元藥理作用明顯、用途廣泛，已經(jīng)有越來越多的學者對其提取工藝進行了研究，更多的新技術(shù)和方法將被運用于薯蕷皂苷元的提取和含量測定中。本文對盾葉薯蕷中皂苷元提取方法和含量測定方法進行了歸納總結(jié)。目前，工業(yè)上的薯蕷皂苷元大多還是酸解法提取的，但是該工藝提取率低、提取周期長、不利于資源綜合利用還會對環(huán)境造成嚴重污染。雖然改進后的酸工藝對提取工藝進行了優(yōu)化，但是仍然不能避免廢液對環(huán)境造成的污染問題。研究發(fā)現(xiàn)分離法可以極大減少酸的用量且能綜合利用淀粉和纖維素，但是該工藝提取的皂苷元得率較低，限制了其應用。近年來開發(fā)的新工藝熱壓分解法完全避免了酸的使用，但該工藝仍然處于試驗階段，還沒有用于工業(yè)生產(chǎn)。此外，生物技術(shù)的在皂苷元生產(chǎn)工藝中的應用越來越受到重視，比如酶解法及微生物轉(zhuǎn)化法，這些新技術(shù)不僅高效且環(huán)境友好。因此，開發(fā)出對環(huán)境友好、皂苷元得率高、資源綜合利用率高、工藝周期短的新工藝是將來工藝研究改進的主要方向。與此同時，隨著薯蕷皂苷元的用途不斷被發(fā)現(xiàn)，其用量也與日俱增，這些選擇性高、穩(wěn)定性好、準確快速且對皂苷元工藝條件、提取方法及不同盾葉薯蕷品種可以進行優(yōu)擇及評價的新含量測定方法在盾葉薯蕷皂苷元的研究中將發(fā)揮巨大的作用。

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