楊青春

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)是一種育齡期女性常見的婦科良性疾病，該病發(fā)病率逐年升高且具有侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為，患者主要癥狀有進(jìn)行性痛經(jīng)、腰骶痛、月經(jīng)異常及不孕等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1，2］。目前，EM的發(fā)病機(jī)制還未完全闡明，有研究顯示異位子宮內(nèi)膜的黏附、侵襲和血管形成是該病病灶種植和增殖的關(guān)鍵和必備條件［3］。本研究探討EM患者組織及血清巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體(VEGFR1、VEGFR2)的表達(dá)及與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2015年1月我院婦產(chǎn)科收治的需經(jīng)腹腔鏡手術(shù)治療的EM患者45例。所有患者有腰骶痛、進(jìn)行性痛經(jīng)、人工流產(chǎn)或不孕史，盆腔檢查可觸及子宮后壁或?qū)m骶韌帶的觸痛結(jié)節(jié)，B超檢查證實(shí)為子宮內(nèi)膜異位囊腫，術(shù)中可見紫藍(lán)色粘連結(jié)節(jié)等，術(shù)后經(jīng)病理確診為EM。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)急慢性感染者;(2)惡性腫瘤患者;(3)合并子宮腺肌癥、子宮肌瘤患者;(4)合并嚴(yán)重心腦血管疾病及肝腎疾病患者;(5)近期服用過性激素類藥物者。參照美國(guó)生育協(xié)會(huì)制定的R-AFS分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期13例，Ⅳ期10例。選取同期于我院體檢的健康女性30例為對(duì)照組。2組年齡、腰圍、體重指數(shù)(BMI)、FSH/LH、孕次、產(chǎn)次等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較 ±s

表1 2組一般資料比較 ±s

組別 年齡(歲) 腰圍(m) BMI(kg/m2)FSH/LH對(duì)照組(n=30)34.12±5.25 0.75±0.09 24.33±4.22 1.43±0.22觀察組(n=45)33.31±5.57 0.79±0.13 23.68±4.01 1.49±0.24

1.2 主要試劑 兔抗人MIF、VEGF單克隆抗體、VEGFR1、VEGFR2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。免疫組化SP試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)SP法:標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚的石蠟切片，65℃烘烤，脫蠟，采用免疫組織化學(xué)染色SP法測(cè)定MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照:3%H2O237℃孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌;微波修復(fù)抗原，PBS洗滌;10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min;用1∶50稀釋的二抗4℃過夜孵育，PBS沖洗;加生物素標(biāo)記的抗人IgG抗體室溫孵育30 min，PBS沖洗;辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育30 min，PBS沖洗;DAB顯色;蘇木素染色，封片，光鏡觀察。

1.3.2 微血管密度(MVD)計(jì)數(shù):將被CD34單克隆抗體棕色染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或一簇細(xì)胞叢作為一個(gè)微血管。采用CD34標(biāo)記的MVD(CD34-MVD)法計(jì)數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞MVD值:100倍光鏡下觀察整個(gè)切片，選取3個(gè)最有代表性的組織切片，排除存在出血和邊緣反應(yīng)區(qū)的切片。低倍鏡下選出每張切片中3個(gè)血管密度最高區(qū)(熱區(qū))，400倍光鏡下計(jì)數(shù)熱區(qū)中被抗CD105抗體染成棕色的單個(gè)或成簇微血管數(shù)，取3個(gè)視野的平均值即為該例切片的MVD值。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA):抽取患者空腹靜脈血10 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法測(cè)定患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Sperman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者組織MIF、VEGFV、EGFR1、VEGFR2的表達(dá)比較 觀察組MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)均為陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 2組患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)比較例(%)

2.2 2組患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)比較 觀察組MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 2組患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)比較±s

表3 2組患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)比較±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 MIF(ng/ml) VEGF(pg/ml) VEGFR1(pg/ml)VEGFR2(pg/ml)對(duì)照組(n=30)7.1±1.2 92.1±12.9 130.2±21.2 225.3±31.6觀察組(n=45) 19.5±3.2* 185.0±25.2* 226.6±33.6* 384.6±46.2*

2.3 2組患者組織MVD計(jì)數(shù)比較 觀察組MVD計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 2組患者組織MVD計(jì)數(shù)比較 個(gè)/Hp，±s

表4 2組患者組織MVD計(jì)數(shù)比較 個(gè)/Hp，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別MVD對(duì)照組(n=30)15.7±2.4觀察組(n=45) 35.3±5.7*

2.4 EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)與MVD值的相關(guān)性 Sperman相關(guān)分析顯示，EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)與MVD值均呈正相關(guān)性(r值分別為0.762、0.814、0.876、0.798，P＜0.05)。

2.5 EM患者組織不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)比較 不同R-AFS臨床分期患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)率均不同，R-AFS臨床分期越高者 MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)率越高(P＜0.05)。見表5。

2.6 EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)與R-AFS臨床分期的相關(guān)性 Sperman相關(guān)分析顯示，EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)率與病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性(P＜0.05)。見表6。

表5 EM患者組織不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2陽(yáng)性表達(dá)比較 例(%)

表6EM患者組織MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)與R-AFS臨床分期的相關(guān)性

2.7 EM患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)與R-AFS臨床分期的相關(guān)性 不同R-AFS臨床分期患者血清中MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)水平均不同，R-AFS臨床分期越高者M(jìn)IF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)水平越高(P＜0.05)。Sperman相關(guān)分析顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)水平與病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性(P＜0.05)。見表7、8。

3 討論

EM是子宮內(nèi)膜樣組織出現(xiàn)在子宮外其他部位，是好發(fā)于育齡期女性的常見、慢性婦科疾病，該病具有侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，是不孕癥的主要發(fā)病原因之一，對(duì)患者生育能力和生活質(zhì)量均造成嚴(yán)重影響［1，2］。目前，EM的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，研究顯示EM的發(fā)生發(fā)展與血管形成、炎性反應(yīng)、激素水平、細(xì)胞免疫或體液免疫等因素有關(guān)［3］。

表7 EM患者血清不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)比較 ±s

表7 EM患者血清不同R-AFS臨床分期MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)比較 ±s

注:與Ⅰ期比較，*P＜0.05;與Ⅱ期比較，#P＜0.05;與Ⅲ期比較，△P＜0.05

類別 MIF(ng/ml) VEGF(pg/ml) VEGFR1(pg/ml) VEGFR2(pg/ml)Ⅰ期(n=10) 6.04±0.93 97.65±10.34 126.35±18.21 230.21±32.28Ⅱ期(n=12 16.10±2.52* 161.23±22.48* 201.59±29.77* 324.16±44.32*Ⅲ期(n=13) 22.73±3.41*# 210.12±30.23*# 263.61±37.55*# 432.65±51.38*#Ⅳ期(n=10) 32.95±3.91*#△ 270.95±42.44*#△ 314.95±48.75*#△ 551.32±59.45*#△

表8 子宮內(nèi)膜異位癥患者血清MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)與R-AFS臨床分期的相關(guān)性

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)是活化的T細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的一種免疫炎性因子，在糖皮質(zhì)激素、脂多糖、TNF-α等細(xì)胞因子刺激下可誘導(dǎo)釋放，參與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖及分化、惡性腫瘤形成等多種生理和病理過程［4］。臨床研究表明MIF在正常組織和血清僅微弱表達(dá)，而EM患者在位內(nèi)膜組織MIF表達(dá)增高［5，6］。Pan等［7］研究發(fā)現(xiàn) MIF能夠增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，從而促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和植入。有研究發(fā)現(xiàn)MIF通過上調(diào)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)血管生成過程，并通過下調(diào)p53基因表達(dá)抑制EM患者異位內(nèi)膜的凋亡［8，9］。以上研究表明MIF從多個(gè)環(huán)節(jié)參與EM的發(fā)生及進(jìn)展，與EM發(fā)生密切相關(guān)。

研究顯示新生血管形成在EM病理過程中具有至關(guān)重要的作用，為異位子宮內(nèi)膜的移行、種植及增殖提供了必要條件［10］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是迄今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的促血管生成因子，與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體(VEGFR1和VEGFR2)具有高度親和力，結(jié)合后通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂發(fā)揮促血管生成作用。研究顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF通過自分泌方式上調(diào)自身表達(dá)VEGFR1和VEGFR2，同時(shí)VEGFR1和VEGFR2又可正反饋調(diào)節(jié)VEGF蛋白表達(dá)，從而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化及血管通透性發(fā)揮聯(lián)合調(diào)控作用［11，12］。另外，VEGF還能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MMPs并分泌組織蛋白酶，通過對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解減弱了基質(zhì)的屏障作用，這為血管生長(zhǎng)和異位子宮內(nèi)膜的種植、增殖提供了有利條件，而異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)又可表達(dá)更多的VEGF，后者進(jìn)一步刺激新生血管形成，促進(jìn)了病灶不斷蔓延擴(kuò)大。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者組織和血清高表達(dá)MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2，與正常子宮內(nèi)膜組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)與病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與有關(guān)研究結(jié)果［9，12］一致，說明MIF可能通過上調(diào)VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)促進(jìn)了新生血管形成，在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用。此外，本研究表明EM患者微血管密度明顯高于正常人組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明EM患者異位內(nèi)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及新生血管形成較正常內(nèi)皮細(xì)胞異?；钴S，促進(jìn)血管網(wǎng)的形成及異位病灶的蔓延擴(kuò)散。

綜上所述，本結(jié)果表明EM患者高表達(dá) MIF、 VEGF、VEGFR1、VEGFR2，且R-AFS臨床分期高者的表達(dá)水平越高，提示MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2在EM血管生成中發(fā)揮協(xié)同作用。MIF可能通過上調(diào)VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)誘導(dǎo)新生血管的形成。采用特異性siRNA、抗體或血管生成抑制劑下調(diào)MIF、VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)有望為抑制異位病灶的植入、侵襲和轉(zhuǎn)移提供基因治療的新靶點(diǎn)。

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