易剛強(qiáng)??+蔡嘉洛??+朱貽霖??+張亞利??+劉峰??+劉湘丹??+高昱??+童巧珍??

摘要：對(duì)Trizol法、CTAB法、十二烷基磺酸鈉（SDS）法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法5種RNA提取方法提取金銀花葉片、莖、根、花蕾組織RNA的效果進(jìn)行比較，以期獲得質(zhì)量較好的金銀花不同器官的RNA，為后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：改進(jìn)后的多糖多酚試劑盒法能夠克服金銀花中RNA提取難度大的問題，能夠提取到質(zhì)量、產(chǎn)量都很高的RNA，且穩(wěn)定性好、無DNA污染，可以滿足進(jìn)一步的半定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）等試驗(yàn)需要。

關(guān)鍵詞：金銀花；不同組織；總RNA；提取方法；改良多糖多酚試劑盒

中圖分類號(hào)： S184文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0063-03

金銀花（Floe Lonicerae）別稱忍冬花、銀花等，為忍冬科（Capfifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）以及同屬多種植物的干燥花蕾及其初開的花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱等功效[1]。當(dāng)前，隨著人們消費(fèi)水平的提高及對(duì)中藥材日益增長的需求，提高金銀花的綠原酸產(chǎn)量、品質(zhì)已經(jīng)具有重大意義。有研究表明，在金銀花綠原酸研究中，對(duì)控制綠原酸等活性物質(zhì)相關(guān)酶基因在金銀花不同部位的表達(dá)模式進(jìn)行分析極其重要；同時(shí)，反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、cDNA文庫構(gòu)建等都需要高質(zhì)量的RNA。目前，金銀花總RNA提取方法包括Trizol法、SDS法等[2-4]。本研究以金銀花根、莖、葉、花蕾為材料，通過對(duì)Trizol法、CTAB法、SDS、多糖多酚試劑盒法、改良多酚試劑盒法行比較，探索從富含多糖的金銀花組織中提取高質(zhì)量、無DNA污染的RNA方法，以期為金銀花分子生物學(xué)研究及提高其活性成分含量研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試材料為金銀花的葉片、根、莖、花蕾。均取自湖南省隆回縣金銀花產(chǎn)業(yè)化種植基地（均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周日寶教授鑒定為正品）。

RNA提取過程中使用的槍頭、槍頭盒、離心管等塑料器皿均用0.1% DEPC水浸泡4 h后高壓蒸汽滅菌、烘干，研缽用75%乙醇潤洗消毒。試驗(yàn)中所用提取液以及各種液態(tài)試劑均用0.1% DEPC水配制，于37 ℃放置過夜以抑制RNase活性。研缽、藥匙及玻璃器皿用鋁箔紙包好后于180 ℃烘箱中干熱滅菌6～8 h。

各種試劑配制參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行。各種方法提取總RNA均定容為20 μL，重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.2RNA提取方法

每種材料均比較了CTAB法[5-6]、SDS法[7-8]、Trizol法[9]、多酚多糖試劑盒法、改良多酚多糖試劑盒法提取RNA的效果。

1.2.1改良CTAB法稱取0.2 g樣品，參照孟麗等CTAB法[10]并略加改進(jìn)進(jìn)行提?。ǜ倪M(jìn)措施：①盡量采收幼嫩的植物組織作為提取DNA的材料；②將采集的樣品及時(shí)放入液氮中；③在DNA緩沖液中加入β-巰基乙醇的用量達(dá)2.5%～3.0%；④在提取獲得的DNA樣品中加入RNase）。

1.2.2Trizol法稱取0.2 g樣品，參照陳靜等的Trizol法[9]進(jìn)行提取。

1.2.3SDS法稱取0.2 g樣品，參照王暑輝等SDS法[4]進(jìn)行提取。

1.2.4多糖多酚試劑盒法稱取0.2 g樣品，按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）說明書進(jìn)行規(guī)范化操作。

1.2.5改良的多糖多酚試劑盒法稱取0.2 g樣品，按照浙江BioFlus多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書，在步驟3后添加等體積酚-三氯甲烷抽提這一步驟；同時(shí)，每步操作均在冰盒內(nèi)進(jìn)行；在最后的DEPC處理水定容階段，將原來的50 μL改為20 μL；其他過程同試劑盒說明書[11-12]。

1.2.6RNA完整性檢測分別取1 μL各器官的總RNA，在1.0%質(zhì)量濃度的凝膠上分析RNA的完整性、質(zhì)量。由于通常情況下，總RNA研究中的利用特點(diǎn)與要求，主要依據(jù)28S、18S rRNA凝膠電泳時(shí)所形成的譜帶特征。如果帶型清晰且亮度高，則表明所提取到的RNA樣品量大且質(zhì)量高，而且以28S rRNA譜帶亮度高于18S rRNA更佳。同時(shí)，根據(jù)電泳結(jié)果還可以判斷RNA樣品中有無DNA、蛋白污染。

1.2.7總RNA純度、濃度測定分別取1 μL根、莖、葉、花蕾的總RNA，稀釋50倍后用核酸測定儀（Eppendorf，Biophotometer plus 6132），分別測量230、260、280 nm處的吸光度并計(jì)算D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值和RNA得率。

1.2.8半定量RT-PCR方法根據(jù)試驗(yàn)中高通量測序中金銀花β-actin序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物：β-actin-F：5′-AGGAACCACCGATCCAGACA-3′；β-actin-R：5′-GGTGCCCTGA GGTCCTGTT-3′。利用cDNA末端快速克?。╮apid-amplification of cDNA ends，RACE）合成金銀花[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]基因cDNA序列，設(shè)計(jì)目的基因RT-PCR反應(yīng)引物：[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]-F：5′-ATGGGTCGAGGGAAGATTGAGA-3′；[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]-R：5′-TATGCCCATTTGACTCTCAGAG-3′。

以提取金銀花各器官的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2結(jié)果與分析

2.1RNA純度及濃度測定

2.2RNA完整性分析

用改良CTAB法提取的金銀花根、莖、葉、花蕾總RNA，本研究只對(duì)花蕾、嫩葉片的RNA電泳圖進(jìn)行分析，根、莖、電泳圖未列出。

分別取5 μL RNA樣品，在1.0%非變性瓊脂糖凝膠上進(jìn)

行電泳檢測。圖1-a為SDS提取法電泳結(jié)果，可見RNA條帶明顯，但拖尾嚴(yán)重，且5S條帶較亮，說明RNA存在很大程度的降解；同時(shí)，可見樣品有較為嚴(yán)重的DNA污染。圖1-b為改良CTAB提取法電泳結(jié)果，圖中28S、18S條帶清晰，28S條帶的亮度約為18S條帶亮度的2倍，5S條帶隱約可見，未見DNA污染。圖1-c為Trizol法電泳結(jié)果，圖中未見RNA條帶。圖1-d為多糖多酚試劑盒法電泳結(jié)果，圖中28S、18S條帶清晰，28S條帶的亮度約為18S亮度的2倍，5S條帶隱約可見，但可見輕微DNA污染。圖1-e為改良的多糖多酚試劑盒法電泳結(jié)果，圖中28S、18S條帶清晰，28S條帶的亮度約為18S亮度的2倍，未見DNA污染。[FL）]

[FK（W+64mm][TPYGQ1.tif][FK）]

[FL（2K2]結(jié)合圖1、表1分析可知：SDS法、Trizol法提取的樣品，無法滿足后續(xù)試驗(yàn)要求；改良CTAB法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法所提取的樣品純度高、完整性好，基本滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.33種提取法提取各器官總RNA半定量RT-PCR檢測結(jié)果

根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室高通量測序及RACE技術(shù)得到金銀花基因設(shè)計(jì)引物，以改良CTAB法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法提取的金銀花根、莖、葉、花蕾總RNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR（β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因）。由圖2可知，改良多糖多酚試劑盒提取法PCR擴(kuò)增效果最佳，同時(shí)也表明[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]基因在金銀花各部位中都有表達(dá)，在花蕾中表達(dá)量最高，在根、葉中的表達(dá)量次之，在莖中最低。與已有文獻(xiàn)報(bào)道的同源基因結(jié)果基本一致，說明改良多糖多酚試劑盒提取法提取的金銀花各器官的總RNA質(zhì)量較好，可以進(jìn)行半定量RT-PCR等后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)。

3討論

大量研究表明，雖然植物RNA的提取方法有多種[13-15]，但是所獲得的RNA質(zhì)量各有差異。由于不同植物組織成分的差異，其最適用的提取方法也不盡相同。特別是多酚、多糖含量高的植物材料，內(nèi)源、外源RNA酶含量豐富。在完整的植物細(xì)胞內(nèi)，這些物質(zhì)與核酸是分離的；一旦細(xì)胞碎裂，即與RNA相互作用，影響高質(zhì)量RNA的提取，導(dǎo)致各組織RNA提取過程中常出現(xiàn)產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解等問題，有時(shí)甚至不能用于相關(guān)研究。因此，RNA提取一直是影響金銀花分子生物學(xué)研究的難點(diǎn)，在RNA提取的整個(gè)過程中，除了保證環(huán)境的干凈、操作過程中不要引入雜質(zhì)及細(xì)菌外，重點(diǎn)要除凈細(xì)胞里的多糖、多酚、蛋白質(zhì)及DNA等雜質(zhì)，并不要?dú)埩籼崛∵^程中所加入的試劑。

從不同提取方法的試驗(yàn)結(jié)果比較分析可知，Trizol法、SDS法不能提取樣品中的RNA，而廣泛應(yīng)用于多糖多酚樣品的改良CTAB法能提取出效果較好的RNA；同時(shí)，使用有針對(duì)性的多糖多酚試劑盒則能提取出效果最好的RNA，證明金銀花樣品多糖多酚類成分含量很高。對(duì)于不同植物種類，體內(nèi)積累的次生代謝產(chǎn)物不同，由于化學(xué)組分差異，沒有一種適合所有植物核酸的提取方法。因此，在進(jìn)行植物樣品總RNA提取前，首先應(yīng)了解樣品的性質(zhì)，根據(jù)其所含相關(guān)次生代謝產(chǎn)物，選擇適合該樣品的有效提取方法，提取出高質(zhì)量的RNA，以便繼續(xù)下一步的試驗(yàn)操作。

本試驗(yàn)中改良CTAB法能提取出質(zhì)量較好的總RNA，且基本能滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求，但相對(duì)多糖多酚試劑盒、改良多糖多酚試劑盒法來說，效果較差。經(jīng)過分析，可能存在以下幾個(gè)方面的原因：（1）CTAB法提取需要LiCl沉淀過夜，提取周期長，而多糖多酚試劑盒整個(gè)提取過程僅需要1.5 h即能完成，避免了長時(shí)間的放置，使RNA降解；（2）改良CTAB法提取所用的所有試劑（CTAB提取液、SSTE、LiCl等）均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室于使用前配置，需要嚴(yán)格滅菌；（3）改良CTAB法提取全程須在冰上操作，但反復(fù)的操作可能導(dǎo)致溫度不恒定。改良CTAB法提取RNA樣品過程中須嚴(yán)格控制低溫、快速、無污染這3點(diǎn)，以上因素即可能成為導(dǎo)致本試驗(yàn)中改良CTAB法提取效果差于多糖多酚試劑盒的主要原因。

因此可見，以上5種提取方法中，SDS法提取的樣品不合格，Trizol法未見有RNA提出，改良CTAB法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法提取的金銀花總RNA樣品純度高、完整性好、降解少，基本都能滿足RT-PCR、分子克隆、高通量測序、實(shí)時(shí)定量PCR（q-PCR）等后續(xù)試驗(yàn)要求，其中以改良的多糖多酚試劑盒法最佳，該方法能提取到高質(zhì)量RNA。本研究結(jié)果為金銀花總RNA提取指明了方向。同時(shí)，高純度的RNA提取也為我們對(duì)金銀花綠原酸等活性成分合成關(guān)鍵酶基因的相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄過程分析提供了保障，幫助我們了解金銀花中活性成分的合成機(jī)制，為進(jìn)一步提高金銀花藥材中活性成分的積累打下基礎(chǔ)。

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