賈建麗 蔡勁松 戚翔 楊幼明 閆靜 李雪 徐雪

缺血性腦血管疾病是一種發(fā)生于中老年的常見病 和多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率均很高，并且有上升趨勢和年輕化趨勢。如何防治腦缺血再灌注損傷，減輕腦缺血再灌注損傷，尋求一種合適有效的治療藥物及措施，一直是臨床各科室所關(guān)注的問題。對于既往存在缺血性腦血管疾病的患者實施手術(shù)，麻醉過程中的腦保護問題尤為重要，可以最大程度地減少圍術(shù)期腦血管意外情況的發(fā)生。右美托咪定(DEX)是一種新型高效高選擇性的α2腎上腺素能受體激動劑，有鎮(zhèn)靜、抗焦慮、鎮(zhèn)痛、抑制交感神經(jīng)、明顯減少麻醉藥的用量和穩(wěn)定血流動力學(xué)等特點，且呼吸抑制作用?。?］。因其獨特的藥理特性在臨床麻醉的特殊治療領(lǐng)域:喚醒麻醉［2］、困難氣道［3］、兒童用藥［4］等方面顯示出來極大的優(yōu)越性，基礎(chǔ)研究已證實DEX對腦缺血再灌注損傷具有一定保護作用［5，6］，但預(yù)先給藥是否具有腦保護作用，筆者未見報道。本研究以此為切入點，研究不同劑量DEX預(yù)先給藥是否具有腦保護作用，且是否具有劑量依賴性。旨在進一步為臨床用藥提供有力的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠40只，月齡3～3.5個月，體重 280～350 g，合格證號: 1303097，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗前，所有動物均在安靜清潔的實驗室喂養(yǎng)2～3 d以適應(yīng)實驗室環(huán)境，室溫23℃，12 h間隔照明，以標(biāo)準(zhǔn)大鼠營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，任其自由進食水。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備:10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉成功后，采用Pulsinelli-Brierley等［7］的四血管閉塞改良法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠清醒后放回單獨的鼠籠飼養(yǎng)。動物存活24 h后，不行麻醉將其仰臥位固定于鼠板上，頸部正中切口，長約3 cm，鈍性分離頸部肌肉，暴露雙側(cè)頸總動脈，用1～0的細(xì)絲線穿過頸總動脈備用。尾靜脈穿刺置管，接微量泵以備輸入DEX或0.9%氯化鈉溶液。采用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈，造成動物全腦缺血，15 min后松開動脈夾，恢復(fù)腦血流灌注，模型制備成功的標(biāo)志為血流阻斷后1 min內(nèi)大鼠的意識喪失，翻正反射及對光反射消失，瞳孔散大，顏色蒼白，呼吸加快，在整個缺血期內(nèi)維持不變?；謴?fù)血流灌注后，瞳孔顏色立即變成鮮紅色，瞳孔縮小至正常水平，意識漸漸恢復(fù)，翻正反射恢復(fù)，并在整個再灌注期內(nèi)維持不變。S組:假手術(shù)組，僅接受手術(shù)而不遭受全腦缺血打擊，術(shù)中予持續(xù)靜脈泵注0.9%氯化鈉溶液2 h，輸注速度2 ml/h。C組:缺血再灌注對照組，全腦缺血15 min后再灌注30 min，在全腦缺血前2 h予以持續(xù)靜脈泵注0.9%氯化鈉溶液2 h，輸注速度2 ml/h。D1組:DEX低劑量組，全腦缺血前2 h予以DEX首次劑量(6 μg/kg)10 min內(nèi)靜脈輸注，剩余劑量以0.05 μg·kg-1·min-1持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度2 ml/h(DEX用0.9%氯化鈉溶液稀釋)。D2組:DEX中劑量組，全腦缺血前2 h予以DEX首次劑量(60 μg/kg)10 min內(nèi)靜脈輸注，剩余劑量以0.5 μg·kg-1·min-1持續(xù)靜脈泵注2 h，輸注速度2 ml/h(DEX用0.9%氯化鈉溶液稀釋)。

1.2.2 全腦缺血模型的建立:采用Pulsinelli-Brierley等的四血管閉塞改良法建立大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠清醒后放回單獨的鼠籠飼養(yǎng)。

1.2.3 腦組織含水量測定:模型制備成功，大鼠再灌注30 min后，每組隨機取4只，立即斷頭取腦，在冰浴中剝出大腦，左側(cè)大腦行腦組織含水量測定。4組實驗動物在缺血再灌注30 min后，立即斷頭取腦，取左側(cè)大腦用萬分之一的電子分析天平稱濕重后，置入110°C恒溫干燥箱烤干至恒重(2次稱重差別＜0.2 mg)后，用同一電子天平再精確稱干腦組織重量，并按照eliot干濕重法計算腦組織含水量，以百分率表示。腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重× 100%。

1.2.4 病理檢測:模型制備成功，大鼠再灌注30 min后，每組隨機取4只，先快速輸入0.9%氯化鈉溶液200～300 ml進行心臟灌注，繼而以4℃ 4%的多聚甲醛固定液(pH值7.4，0.1 mol/L PB配置)300～400 ml進行心臟灌注，30～60 min完成灌注。開顱取腦，左右兩側(cè)大腦分別置入4℃4%的多聚甲醛中和4%的戊二醛中備病理、電鏡檢測。

1.2.5 光鏡標(biāo)本采集:擬行光鏡檢測標(biāo)本，于視交叉后緣每隔2 mm平行作3個冠狀切面，取2片2 mm厚的腦組織于4%多聚甲醛固定液中再固定24 h，經(jīng)常規(guī)梯度脫水、透明、浸蠟包埋，切片厚為5 μm。行蘇木紫-伊紅染色。

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察:擬行電鏡檢測標(biāo)本，冰盤上迅速選取海馬CA1區(qū)組織，按“快、小、輕、準(zhǔn)”的原則取材，以鋒利刀片于視交叉后4 mm冠狀切開右側(cè)腦組織，切取海馬CA1區(qū)標(biāo)本3～4塊，大小為1 mm ×1 mm×1 mm。經(jīng)固定、清洗、梯度脫水、浸透、包埋、聚合后，超薄切片機切厚約40 nm的切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色電子染色后應(yīng)用JEM-1230(日本)透射電鏡拍片，觀察神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、線粒體、高爾基體等超微結(jié)構(gòu)的變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料正態(tài)分布數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，并進行方差齊性檢驗，如方差不齊則采用秩和檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠體重和月齡比較 4組大鼠的體重、月齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 4組大鼠體重和月齡比較 n=10，±s

表1 4組大鼠體重和月齡比較 n=10，±s

組別 體重(g) 月齡(月) S組311±24 3.28±0.20 C組 314±24 3.25±0.16 D1組 325±20 3.32±0.15 D2組316±23 3.29±0.22

2.2 DEX預(yù)先給藥對大鼠全腦缺血再灌注損傷后腦水含量的影響 腦組織水含量的測定結(jié)果表明，與S組比較，C組、D1組、D2組大鼠腦組織含水量明顯升高(P均＜0.05);與C組比較，D1組、D2組大鼠腦組織含水量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 4組大鼠缺血再灌注后腦組織含水量變化n=5，%，±s

表2 4組大鼠缺血再灌注后腦組織含水量變化n=5，%，±s

注:與S組比較，*P＜0.05

組別 腦組織含水量S組79.11±0.26 C組 80.15±0.61* D1組 80.04±0.46* D2組 79.87±0.77*

2.3 DEX預(yù)先給藥對大鼠全腦缺血再灌注神經(jīng)病理觀察 S組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層神經(jīng)元有3～4層，排列整齊緊密，細(xì)胞界限清晰，胞核呈圓形或橢圓形，淡染，占整個細(xì)胞的2/3，有1～2個核仁，呈圓形，深染;C組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列散亂，大量錐體細(xì)胞核水腫，透明，少數(shù)細(xì)胞體積變小成三角形，核濃縮深染，結(jié)構(gòu)消失;D1組、D2組較C組腦組織病變輕，多數(shù)錐體細(xì)胞存活，固縮神經(jīng)元數(shù)量及神經(jīng)元缺失明顯減少。

2.4 DEX預(yù)先給藥對大鼠全腦缺血再灌注后4組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 S組:神經(jīng)元細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，核膜清楚，核仁清晰;胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器正常，線粒體形態(tài)不一，線粒體嵴清晰規(guī)則，高爾基體囊泡排列規(guī)則;毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及星形細(xì)胞正常。

2.4.2 C組:神經(jīng)細(xì)胞周圍可見明顯水腫帶，胞質(zhì)水腫，線粒體電子密度增高，腫脹，嵴斷裂、減少、或消失，高爾基體囊泡擴張;星形細(xì)胞明顯腫脹;毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，管周明顯水腫。見圖1。

圖1 C組超微結(jié)構(gòu)變

2.4.3 D1組:神經(jīng)細(xì)胞周圍仍可見水腫，但較C組減輕;線粒體電子密度增高，腫脹，高爾基體囊泡擴張;星形細(xì)胞腫脹較C組減輕;毛細(xì)血管周圍可見水腫。見圖2。

圖2 D1組超微結(jié)構(gòu)變化

2.4.4 D2組:神經(jīng)細(xì)胞周圍仍可見水腫，但較C組減輕;線粒體電子密度增高，略腫脹，高爾基體囊泡略擴張;星形細(xì)胞略腫脹;毛細(xì)血管周圍水腫。見圖3。

3 討論

大鼠全腦缺血再灌注動物模型的建立方法有很多種，常見的有兩血管阻斷伴低血壓模型、沙土鼠兩血管阻斷法、Pulsinelli等［7］的四血管阻斷法、頸動脈分流動物模型等。其中，四血管阻斷法全腦缺血再灌注動物模型在國內(nèi)使用較多，它的解剖學(xué)基礎(chǔ)在于大鼠腹側(cè)脊髓動脈有一定向腦干的返支，四血管阻斷期間可以維持腦干的血液供應(yīng)，使大鼠在一定時間內(nèi)能夠存活下來。其優(yōu)點是缺血效果確切，操作相對簡單，實驗重復(fù)性好，可較好的模擬臨床上因心臟驟停、嚴(yán)重低血壓休克、心肺腦復(fù)蘇等所致的缺血性腦損傷過程，這是本研究采用此模型的依據(jù)。

圖3 D2組超微結(jié)構(gòu)變化

血腦屏障將中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)隔離開來，防止血漿中對腦組織有毒性作用的物質(zhì)進入腦內(nèi)，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能正常。血腦屏障破壞后導(dǎo)致血液中毒性物質(zhì)進入腦內(nèi)，離子平衡失調(diào)引起腦水腫，通常腦組織含水量增加的多少，反映腦組織水腫程度［8］。腦缺血再灌注后繼發(fā)的腦水腫，會降低腦的灌注壓，損害毛細(xì)血管和增大氧氣從血液彌散到細(xì)胞的距離，從而進一步加重原有的腦缺血病變。腦組織含水量測定是反映腦水腫的重要指標(biāo):腦水腫時腦組織含水量增加，腦含水量的高低直接反映腦水腫的嚴(yán)重程度，同時也可反映腦細(xì)胞的損傷程度。本實驗顯示于對照組C組比較，D1、D2組腦組織含水量有降低趨勢，但未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異，可能與標(biāo)本量較少有關(guān)。

大鼠短暫性全腦缺血模型以前腦缺血為主，前腦缺血的病理性變化可累及大腦皮層、紋狀體、杏仁核、丘腦、下丘腦、海馬、中腦、嗅球等區(qū)域，病理性檢測結(jié)果是評價缺血性腦損傷的金標(biāo)準(zhǔn)。海馬是缺血性腦損傷最易感的組織之一，海馬在低倍鏡下呈“C”形，分為CA1、CA2、CA3、CA4四個區(qū)，短暫性全腦缺血模型以CA1區(qū)對缺血最為敏感，CA3區(qū)對缺血有較好的耐受。本實驗主要對CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)進行觀察。研究結(jié)果表明S組CA1區(qū)有3～4層椎體細(xì)胞，排列緊密整齊，高倍鏡下可見椎體細(xì)胞核大而圓、淡染，有1～2個核仁，超微結(jié)構(gòu)下觀察，S組椎體細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，染色質(zhì)密度均一，線粒體、高爾基體等細(xì)胞器豐富，星形細(xì)胞正常。C組全腦缺血15 min后再灌注30 min，CA1區(qū)損傷嚴(yán)重，失去正常結(jié)構(gòu)，椎體細(xì)胞排列散亂，大量椎體細(xì)胞變性，核固縮，椎體細(xì)胞明顯減少，僅殘存極少量形態(tài)相對完好的神經(jīng)元。超微結(jié)構(gòu)下可見神經(jīng)細(xì)胞周圍水腫明顯，胞質(zhì)水腫，線粒體電子密度增高，腫脹，嵴斷裂、減少、甚至消失，高爾基體囊泡擴張，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，管周明顯水腫，星形細(xì)胞明顯腫脹。D1組神經(jīng)細(xì)胞周圍腫脹、星形細(xì)胞腫脹較C組減輕。D2組線粒體雖電子密度仍顯增高，但腫脹較C組減輕。通過超微結(jié)構(gòu)變化可以看出全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)對缺血刺激敏感的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞器在對照組顯示出明顯的損傷改變，細(xì)胞器中以線粒體的改變最為明顯，表現(xiàn)為電子密度增高、嵴斷裂或缺失。分析原因可能是由于缺血改變勢必會導(dǎo)致缺氧性改變，而線粒體由于其特殊的結(jié)構(gòu)和功能最易受缺氧的影響，即受到活性氧的攻擊。線粒體DNA(mtDNA)分布于線粒體內(nèi)膜周圍，臨近活性氧產(chǎn)生的部位，且由于其周圍沒有組織蛋白的保護，即缺乏相關(guān)的DNA修復(fù)酶，極易受到活性氧的攻擊而損傷［9］。正常情況下細(xì)胞內(nèi)同時存在有效的抗氧化防御機制，如呼吸鏈的自我凈化、各種抗氧化酶、DNA修復(fù)系統(tǒng)等，可以及時清除線粒體有氧代謝過程中產(chǎn)生活性氧，使其保持在極低水平，因此很少受到它的傷害。但在一些病理狀態(tài)下，如缺血再灌注損傷發(fā)生后活性氧生成過多過快或者機體抗氧化功能的降低，使線粒體及細(xì)胞發(fā)生受損，表現(xiàn)為線粒體腫脹、畸形、空泡形成等，說明線粒體受到了較嚴(yán)重的損害。D1、D2組可見線粒體嵴的破壞程度減輕、正常線粒體增多，可見經(jīng)右美托咪定預(yù)先給藥后，上述超微結(jié)構(gòu)中細(xì)胞水腫減輕、線粒體腫脹減輕，血管源性水腫和細(xì)胞毒性水腫得到緩解產(chǎn)生了從而產(chǎn)生了一定的保護作用。

綜上所述，全腦缺血再灌注損傷大鼠，低劑量組和中劑量組右美托咪定預(yù)先給藥均可產(chǎn)生有一定的腦保護作用，表現(xiàn)腦組織水腫減輕，超微結(jié)構(gòu)細(xì)胞器腫脹減輕但2組之間未顯示出顯著差異。

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7 Pulsinelli W，Brierley J.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat.Stroke，1979，10:267-272.

8 Iadecola C，Alexander M.Cerebral ischemia and inflammation.Curr Opin Neurol，2001，14:89-94.

9 宋今丹主編.醫(yī)學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.203-229.