陳珊珊，金 華

(1.楚雄醫(yī)藥高等專科學校外科教研室，云南楚雄675000;2.云南省第一人民醫(yī)院麻醉科，云南昆明650031)

脊柱創(chuàng)傷、腫瘤、血管疾病及手術(shù)等引起脊髓局部神經(jīng)細胞因缺血缺氧發(fā)生中心性壞死，當恢復血流灌注后，局部缺血組織繼而出現(xiàn)一系列繼發(fā)性損害，導致?lián)p傷平面以下神經(jīng)功能喪失，稱為脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemic reperfusion injury，SCIRI)。以往的研究認為缺血再灌注時細胞的死亡方式為壞死，但近年來發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡可能是其發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)之一［1］，細胞凋亡分子機制研究發(fā)現(xiàn)caspase、Fas、Bcl－2 等［2］多種基因參與細胞凋亡，其中caspase 家族蛋白酶的激活是細胞凋亡發(fā)生的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］，caspase－9 屬于該家族的重要成員之一，是細胞內(nèi)凋亡調(diào)控途徑即線粒體途徑中的重要組成部分。骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有向神經(jīng)元細胞分化潛能、來源廣泛、取材容易、免疫排斥反應弱等優(yōu)點，是目前用于脊髓損傷治療的有用干細胞［4］。本研究小組先前在完成動脈移植BMSCs 治療SCIRI大鼠模型建立［5］的基礎上，發(fā)現(xiàn)經(jīng)腎下腹主動脈移BMSCs 能明顯減輕SCIRI 大鼠缺血節(jié)段脊髓神經(jīng)元壞死，并促進上下行神經(jīng)纖維再生［6］，因而BMSCs移植有望成為一種有效治療SCIRI 的新方法。本研究采用經(jīng)腎下腹主動脈移植BMSCs，避免了脊髓局部注射途徑的“二次損傷”和外周靜脈注射的“循環(huán)消耗”等缺點，同時具有微創(chuàng)、操作簡便、定位準確和分布均勻等優(yōu)點。通過觀察移植后動物行為學功能、脊髓細胞凋亡和caspase－9 表達變化，探討經(jīng)腎下腹主動脈移植BMSCs 改善SCIRI 大鼠脊髓功能的另一可能的凋亡機制，為BMSCs 移植治療SCIRI提供更有利的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD 大鼠40 只，其中雌性大鼠24 只，質(zhì)量200～220 g;幼年大鼠16 只，雌雄不限，體質(zhì)量30～40 g(昆明醫(yī)科大學實驗動物科，合格證號:SYXK 滇2005－2004)。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)液和胎牛血清(Hyclone 公司);小鼠抗大鼠CD44(Chimecon 公司);PV－9000 二步法免疫組化試劑盒和DAB 顯色試劑盒(中山金橋生物技術(shù)公司);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒和PCR 試劑盒(Fermentas 公司);TUNEL試劑盒(Roche 公司)，小鼠抗大鼠caspase－9(Chemicon 公司)，小鼠抗大鼠β－actin 和HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 二抗(Stanta Cruz 公司)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs 體外培養(yǎng)與鑒定:脫頸椎法處死幼年大鼠，浸泡于75%乙醇溶液中浸泡消毒2～3 min，轉(zhuǎn)入超凈工作臺，無菌條件下剝離出雙側(cè)股骨骨髓腔內(nèi)骨髓用于培養(yǎng)BMSCs，培養(yǎng)至第3 代細胞用于CD44 免疫染色，具體方法參見本研究小組先前完成的腎下腹主動脈移植骨髓間充質(zhì)干細胞治療脊髓缺血再灌注損傷大鼠模型的建立［5］。

1.3.2 動物分組與模型制備:將大鼠隨機分為假手術(shù)組(sham group)、缺血再灌注組(ischemic reperfusion group，I/R)和移植組(BMSC group)，每組8只。動物模型制備在本研究小組先前建立的大鼠脊髓缺血再灌注損傷改良模型［7］基礎上完成，假手術(shù)組僅行手術(shù)操作;缺血再灌注組阻斷腎下腹主動脈120 min 后開放，恢復脊髓再灌注5 min 后經(jīng)動脈留置套管針緩慢推注10% FBS 1 mL;移植組手術(shù)操作與缺血再灌注組相同，向套管針內(nèi)推注1 mL BMSCs懸液(1 ×106cell/mL)。術(shù)畢認真檢查手術(shù)部位，沒有滲血后逐層縫合。所有術(shù)后大鼠每天腹腔注射青霉素20 萬U 預防感染，對于術(shù)后截癱的動物，每天早晚按摩膀胱排尿，必要時給予開塞露排便。

1.3.3 神經(jīng)行為學評價:采用Basso 等［8］提出的BBB 評分體系于術(shù)后1、3 和7 d 對所有大鼠進行行為學評估，包括0～21 級，完全功能缺失為0 分，完全正常鼠為21 分，評價的內(nèi)容主要包括大鼠后肢的運動、軀干位置及穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪的置放、足趾間隙以及尾的位置等。由3 位熟悉評分標準的非本組實驗人員評分，取平均值。

1.3.4 標本采集和處理:術(shù)后7 d 對實驗動物取材，截取L1、L2 脊髓分別用于RT－PCR 和Western blot，并快速轉(zhuǎn)入－80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。截取L3 節(jié)段脊髓置于4% 多聚甲醛內(nèi)作后固定，先后置于15%和30%梯度蔗糖液內(nèi)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片(片厚4 μm)，貼片后37 ℃烤干備用。

1.3.5 RT－PCR 檢測脊髓caspase－9 mRNA 表達:應用PubMed 查找SD 大鼠caspase－9 和內(nèi)參β－actin 的mRNA 序列，利用Premier 5.0 軟件設計引物序列。caspase－9 引物上游序列為5'－CCACTGCCTCATCAT CAACA－3'，下游序列為5' －CCTGGTATGGGACAGCA TCT－3'，擴增產(chǎn)物479 bp。β－actin 引物上游序列為5'－GTAAAGACCTCTATGCCAACA－3'，下游序列為5'－GGACTCATCGTACTCCTGCT－3'，擴增產(chǎn)物227 bp。引物由大連寶生物工程公司合成。

取出凍存的L1 脊髓，Trizol 裂解，三氯甲烷萃取提取總RNA。紫外分光光度法及甲醛變性凝膠電泳鑒定提取RNA 的純度和完整性。按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書合成cDNA。按照PCR Master Mix Kit 說明書操作，以上述cDNA 第一鏈為模板進行聚合酶鏈反應擴增。

PCR 產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳分析，采用1∶20 000 GoldView 顯色，1% TAE 為電極緩沖液，DL－2000 DNA Marker 為電泳條帶對照，180 V 電泳20 min。凝膠成像儀成像觀察電泳帶及其位置，對照Marker 比較擴增產(chǎn)物的大小并對電泳條帶進行吸光度分析，計算caspase－9 PCR 產(chǎn)物與β－actin PCR 產(chǎn)物的吸光度比值。

1.3.6 Western blot 檢測脊髓caspase－9 蛋白的表達:取出凍存的L2 脊髓，蛋白裂解液裂解，玻璃勻漿器機械勻漿、靜止、離心提取蛋白上清液并測定蛋白濃度;采用15%分離膠進行電泳，電泳條件設置為:180 V、100 mA、55 min;在100 V、350 mA、90 min條件下電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜;10%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，將膜封入含caspase－9 抗體(1∶500)塑料袋內(nèi)，置搖床上孵育70 min，采用β－actin 抗體(1∶2 000)作為內(nèi)對照;洗膜后于室溫下將膜封入HRP 標記的二抗(1∶5 000)內(nèi)，置搖床上孵育70 min;常規(guī)洗膜后采用增加化學發(fā)光(ECL)試劑盒顯影曝光成像，采集圖片，利用Quantity One 軟件測定陽性條帶的吸光度值，與相應β－actin吸光度值比較，對特異性caspase－9 蛋白條帶進行半定量分析。

1.3.7 TUNEL 檢測細胞凋亡:組織切片脫蠟后，滴加2 μg/mL 蛋白酶K，37 ℃消化30 min;雙蒸水漂洗樣片后浸入TdT 緩沖液(30 mmol/L Trizma 基礎液，pH 7.2，140 mmol/L 磷酸氫鈉二甲胂酸鹽，1 mmol/L CoCl2)，再孵育于TUNEL 反應液(1 液1 μL，2 液9 μL)，37 ℃標記1 h 后轉(zhuǎn)入4 ℃過夜;用0.01 mol/L PBS 漂洗，滴加堿性磷酸酶，再用PBS漂洗;將樣片置于堿性磷酸酶顯色底物NBT/BCIP液中避光顯色5～10 min，隨后用雙蒸水終止反應。同時做對照試驗，TUNEL 反應液中不加TdT 酶(1 液)。常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固。顯微鏡觀察并采集圖片，每張計算3 個200 倍視野后取平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 生長情況及CD44 染色結(jié)果

圖1 BMSCs 體外培養(yǎng)及CD44 鑒定Fig 1 BMSCs cultured in vitro and identified with CD44 (×200)

接種2～3 d，鏡下可見細胞多以圓形貼壁生長，但貼壁尚不穩(wěn)固，少數(shù)細胞胞體呈索形;培養(yǎng)4～5 d，可見絕大多數(shù)細胞胞體兩端長出突起，突起較短，胞體呈索形或三角形;培養(yǎng)7 d，細胞形態(tài)、極性較為一致，胞體較前扁平，突起較短，呈漩渦狀生長且基本覆蓋滿板底(圖1A)。培養(yǎng)至第3 代的BMSCs胞體扁平呈索形或三角形，細胞突起較短。CD44免疫細胞化學染色可見大量細胞被染為棕色，胞質(zhì)和突起著色，胞核不著色，呈圓形或橢圓形，以橢圓形為主(圖1B)。

2.2 神經(jīng)行為學評分(BBB 評分)

SCIRI 大鼠(缺血再灌注組和移植組)術(shù)后存在嚴重功能障礙，各時間點BBB 評分顯著低于假手術(shù)組(P＜0.01)，大鼠后肢功能隨時間延長出現(xiàn)不同程度的恢復，BBB 評分較同組前一時間點增加(P＜0.01)，其中移植組術(shù)后3、7 d BBB 評分高于缺血再灌注組(P＜0.01)(表1)。

表1 3 組大鼠術(shù)后不同時刻BBB 評分比較Table 1 BBB scores in three groups of rats(±s，n=8)

表1 3 組大鼠術(shù)后不同時刻BBB 評分比較Table 1 BBB scores in three groups of rats(±s，n=8)

*P＜0.01 compared with sham group;#P＜0.01 compared with I/R group.

group1 day after operation 3 days after operation 7 days after operation sham19.8 ±1.420.6 ±1.021.0 ±0 I/R0.8 ±0.3*2.5 ±0.6*4.1 ±1.4*BMSC0.9 ±0.3*5.2 ±1.2* #7.7 ±1.6*#

2.3 Caspase-9 mRNA 和蛋白表達變化

術(shù)后7 d，3 組大鼠脊髓樣本均能檢測到caspase－9 mRNA 和蛋白表達。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和移植組caspase－9 mRNA 和蛋白的表達水平均增高(P＜0.01)，而移植組的表達水平低于缺血再灌注組(P＜0.01)(圖2)。

2.4 脊髓細胞凋亡情況

術(shù)后7 d，假手術(shù)組L3 脊髓內(nèi)無TUNEL 陽性產(chǎn)物，缺血再灌注組和移植組可見大量核被染為藍紫色的凋亡細胞，細胞形態(tài)不一，細胞核固縮，有的呈碎片狀，大小不一致，核內(nèi)散在分布藍紫色顆粒，核膜完整或不完整，并可見凋亡小體分布。移植組凋亡細胞數(shù)(10.0 ± 2.3)較缺血再灌注組(23.0 ±4.8)減少(P＜0.01)(圖3)。

3 討論

本研究中TUNEL 檢測和BBB 評分顯示，與I/R組相比，SCIRI 術(shù)后7d BMSCs 移植組大鼠脊髓內(nèi)凋亡細胞數(shù)明顯減少，BBB 評分顯著增高。提示SCIRI 誘導了損傷脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，表現(xiàn)為動物后肢功能嚴重障礙，而腎下腹主動脈移植BMSCs 則能夠減輕損傷脊髓細胞凋亡的程度，進而改善大鼠后肢功能恢復。

圖2 3 組大鼠術(shù)后7 d 脊髓β-actin 和caspase-9 mRNA 及蛋白表達變化Fig 2 The expression change of β-actin and caspase-9 mRNA and protein in spinal cord of rats in three groups at 7 days post operation

圖3 3 組大鼠術(shù)后7 d L3 脊髓TUNEL 染色Fig 3 The TUNEL staining in spinal cord of rats in three groups at 7 days post operation (×200)

既往關(guān)于細胞凋亡分子機制的研究發(fā)現(xiàn)caspase 家族介導的細胞內(nèi)凋亡調(diào)控途徑中，內(nèi)源性通路主要是線粒體細胞色素C 釋放入胞質(zhì)［9］，與凋亡蛋白酶激活因子和caspase－9 前體結(jié)合，使caspase－9 酶原活化，從而激活下游的效應蛋白caspase－3，活化的caspase－3 既可通過激活底物caspase－6 和caspase－7，共同參與降解底物，也可直接降解下游底物，降解染色體DNA，使DNA 片段化，最終導致細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)I/R 組和BMSCs 移植組大鼠脊髓caspase－9 mRNA 和蛋白表達水平較假手術(shù)組顯著增加，而移植組表達水平較I/R 組減少。結(jié)合上述脊髓凋亡形態(tài)學和動物行為學結(jié)果，說明SCIRI 激活了脊髓caspase 家族蛋白酶，表現(xiàn)為caspase－9 基因和蛋白的表達增加，誘導脊髓細胞凋亡，表現(xiàn)大鼠后肢功能嚴重障礙;而經(jīng)腎下腹主動脈輸注的BMSCs 能夠有效抑制SCIRI 大鼠脊髓caspase－9 的表達，減輕脊髓細胞凋亡，改善大鼠后肢功能恢復，提示動脈移植BMSCs 可能通過下調(diào)SCIRI 后大鼠脊髓內(nèi)源性通路的細胞凋亡相關(guān)蛋白caspase－9 表達來抑制細胞內(nèi)凋亡調(diào)控途徑，從而減輕損傷脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞凋亡，進而改善了SCIRI 大鼠后肢功能。

BMSCs 除具有干細胞自我更新和多向分化潛能的共性外，還具有分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)保護作用［10］，有研究發(fā)現(xiàn)VEGF 可能通過抑制caspase－3 表達減少家兔腦缺血再灌注損傷細胞凋亡的發(fā)生［11］，三七總皂甙可能通過抑制Fas/FasL 系統(tǒng)的激活，減少caspase－3 表達，阻遏肺組織細胞凋亡，從而減輕肺缺血再灌注損傷［12］，因此BMSCs 是否是通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮神經(jīng)保護作用的同時，調(diào)節(jié)損傷脊髓內(nèi)caspase－9 表達來抑制細胞內(nèi)凋亡調(diào)控途徑?亦或通過外源性通路上的caspase－8，或進而激活的caspase－3 來發(fā)揮抗凋亡的作用?目前仍不得而知，這正是本研究組接下來的研究方向，以進一步明確BMSCs 移植治療脊髓損傷的抗凋亡的分子通路。

綜上所述，腎下腹主動脈移植BMSCs 能夠抑制缺血再灌注損傷脊髓caspase－9 表達，減輕脊髓局部細胞凋亡，進而促進SCIRI 大鼠脊髓神經(jīng)功能恢復。本研究為臨床治療脊髓損傷提供了一條新的途徑，為進一步研究BMSCs 移植治療脊髓損傷的機制提供了實驗依據(jù)。

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