夏 飛，伍志盟，李美玲，鄧 莉，胡 勤，郭風(fēng)勁

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)教研室發(fā)育生物學(xué)與模式動(dòng)物平臺(tái)，重慶400016)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)折疊以及修飾、鈣離子儲(chǔ)存的場(chǎng)所，ATF4(activating transcriptional factor4)是蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)下游的重要信號(hào)分子［1］。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中聚集大量錯(cuò)誤折疊蛋白時(shí)，PERK 會(huì)進(jìn)一步被激活，通過(guò)磷酸化真核細(xì)胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)抑制蛋白質(zhì)合成［2］，同時(shí)通過(guò)活化ATF4 上調(diào)C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，Chop)基因的表達(dá)［3-4］，進(jìn)而活化細(xì)胞凋亡途徑的發(fā)生，參與細(xì)胞的整合應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程，參與各種代謝異常、組織損傷等病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)變［5］。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建和包裝了人ATF4 基因重組慢病毒顆粒，并觀察BMP2 誘導(dǎo)C2C12 成骨分化過(guò)程中，ATF4 基因慢病毒修飾對(duì)C2C12 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為進(jìn)一步研究人ATF4 基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為研究C2C12 成骨分化的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

慢病毒表達(dá)載體pWPT-GFP-V5、慢病毒包裝原件載體pMD2G 和pSPAX2(第二軍醫(yī)大學(xué)何志穎教授惠贈(zèng));HEK-293T 細(xì)胞和C2C12 細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、MluⅠ、Taq 聚合酶和DNA Marker(大連寶生物公司);T4DNA 連接酶(Promega 公司);質(zhì)粒小量提取試劑盒和DNA 膠回收純化試劑盒(Omega 公司);DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清(Hyclone 公司);ATF4、CHOP 抗體(Santa Cruz公司);Cleaved-Caspase3 抗體(Abcam 公司);p-JNK抗體(Cell Signaling 公司);HRP 標(biāo)記的抗兔和抗鼠IgG 二抗(北京中杉金橋生物);鼠抗β-actin 單克隆抗體(天津三箭生物技術(shù)有限公司);脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen 公司);SDS-PAGE 凝膠配置試劑盒和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 ATF4 慢病毒載體的構(gòu)建

1.2.1 引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank 中人ATF4 的CDS區(qū)的基因序列，設(shè)計(jì)并合成ATF4 的擴(kuò)增引物，上游引物:cgcggatccTTTCTACTTTGCCCGCCCACAG;下游引物:cgacgcgtACTTTCCCTACAAAATAATTTATTG(下劃線分別為BamHⅠ、MluⅠ酶切位點(diǎn))，以真核表達(dá)載體pcDNA3.1(－)-ATF4 為模板擴(kuò)增ATF4基因，擴(kuò)增片段大小為1 251 bp。

1.2.2 ATF4 重組慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、MluⅠ雙酶切慢病毒載體pWPTGFP-V5，再與ATF4 目的基因通過(guò)T4 連接酶連接，構(gòu)建載體pWPT-GFP-ATF4。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，37 ℃搖床過(guò)夜，質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA 并酶切鑒定和測(cè)序鑒定。

1.3 慢病毒重組體的包裝和靶細(xì)胞感染

轉(zhuǎn)染前1 d 在2 個(gè)6 cm 的培養(yǎng)皿中接種對(duì)數(shù)增殖期的293T 細(xì)胞，次日將慢病毒載體pWPTGFP-V5 和重組慢病毒載體pWPT-GFP-ATF4 分別與輔助包裝質(zhì)粒pMD2G、pSPAX2 混合，按照LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體說(shuō)明書分別將3 種質(zhì)粒充分混合分別轉(zhuǎn)染入293T 細(xì)胞中，3 種質(zhì)粒各自加入12.5、7 和3.5 μg［6-7］。6 h 后換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，48、72 h 分別收集培養(yǎng)上清，0.45 μm 濾器過(guò)濾后－80 ℃保存［8-9］。

1.4 病毒滴度的檢測(cè)

感染前1 d 在24 孔板中接種293T 細(xì)胞，按照孔稀釋法倍比稀釋濃縮的病毒上清，取100 μL 加入細(xì)胞中，孵箱過(guò)夜，第2 天更換DMEM 完全培養(yǎng)液，48 h 后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光數(shù)。1 個(gè)發(fā)綠色熒光的細(xì)胞為1 個(gè)表達(dá)單位(expression forming units，efu)，根據(jù)下面公式計(jì)算病毒滴度(efu/mL)和感染復(fù)數(shù)(MOI)［10］:病毒滴度=發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)/0.1，MOI =病毒滴度×加入病毒體積/感染的細(xì)胞數(shù)。

1.5 FCM 檢測(cè)ATF4 重組慢病毒對(duì)C2C12 細(xì)胞周期和凋亡的影響

1.5.1 細(xì)胞周期的檢測(cè):取對(duì)數(shù)期增殖的C2C12細(xì)胞接種于4 cm×6 cm 細(xì)胞盤，待細(xì)胞匯合至70%時(shí)加入4 μg/mL 的BMP2 蛋白，過(guò)24 h 后分別加入慢病毒LV-ATF4 和慢病毒LV-GFP，并設(shè)立空白對(duì)照NC 組和單BMP2 蛋白處理組。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次(以下方法皆按此處理細(xì)胞)。再過(guò)48 h 后收集各組細(xì)胞用1 mL 的70%乙醇固定24 h，加入等體積的染料PI，4 ℃放置20～30 min后尼龍膜過(guò)濾，F(xiàn)CM 測(cè)定各組細(xì)胞周期情況。該檢測(cè)由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院流式細(xì)胞監(jiān)測(cè)中心完成。

1.5.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè):收集各組細(xì)胞用PBS 洗滌3 次，加入等體積PBS，應(yīng)用FCM Annixin PE 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。該檢測(cè)由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院流式細(xì)胞監(jiān)測(cè)中心完成。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)

各組細(xì)胞分別經(jīng)預(yù)冷的PBS 沖洗3 次后，加入200 μL 的蛋白裂解液，用細(xì)胞刮緩緩刮下收集至1.5 mL 的離心管中，放置冰上充分裂解40 min，4 ℃12 000 ×g 離心15 min。取上清至新的離心管中，加入4 ×SDS 上樣緩沖液，分裝后至－80 ℃保存。3 種蛋白各取20 μL 于10% SDS-PAGE 電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上1 h，5%的脫脂奶粉封閉1 h;分別加入β-actin 鼠抗抗體和目的抗體，4 ℃過(guò)夜。次日吸取抗體液，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，ECL 顯影。

1.7 透射電鏡

收集上述各組細(xì)胞，加入戊二醛固定液后送往重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢病毒的滴度測(cè)定及最佳感染復(fù)數(shù)的確定

經(jīng)倍比稀釋法測(cè)定(圖1A)得到慢病毒LVATF4 的滴度約為1 ×108efu/mL。LV-ATF4 慢病毒分別按感染復(fù)數(shù)(The multiplicity of infection，MOI)為20、40、60 的梯度感染C2C12 細(xì)胞，48 h 后熒光顯微鏡下觀察熒光(圖1B)，結(jié)果顯示MOI =40 時(shí)，綠色熒光最強(qiáng)。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示ATF4 慢病毒感染C2C12 細(xì)胞后ATF4 蛋白表達(dá)明顯增多(圖1C)。

2.2 FCM 檢測(cè)ATF4 重組慢病毒對(duì)C2C12 細(xì)胞周期的影響

NC 組、BMP2 組和BMP2 +LV-GFP 組3 組之間細(xì)胞周期S 期差異不顯著，而實(shí)驗(yàn)組BMP2 + LVATF4 細(xì)胞周期S 期與對(duì)照組BMP2 +LV-GFP 相比明顯下降(P＜0.05)(圖2)。

2.3 FCM 檢測(cè)ATF4 重組慢病毒對(duì)C2C12 細(xì)胞凋亡的影響

BMP2 組和BMP2 +LV-GFP 組凋亡率高于NC組，實(shí)驗(yàn)組BMP2 +LV-ATF4 凋亡率為31.06%，顯著高于對(duì)照組BMP2 + LV-GFP(11.86%)(P＜0.05)(圖3)。

2.4 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

BMP2 +LV-ATF4 實(shí)驗(yàn)組凋亡相關(guān)基因cleaved caspase-3、Chop 與p-JNK 的表達(dá)與BMP2 +LV-GFP對(duì)照組相比均明顯增加(P＜0.05)(圖4)。

2.5 透射電鏡檢測(cè)凋亡小體

在BMP2 持續(xù)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，NC組、BMP2 組和BMP2 +LV-GFP 組細(xì)胞都未出現(xiàn)凋亡小體，而實(shí)驗(yàn)組BMP2 +LV-ATF4 細(xì)胞檢測(cè)出現(xiàn)凋亡小體結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖2 FCM 監(jiān)測(cè)在BMP2 處理?xiàng)l件下ATF4 重組慢病毒對(duì)C2C12 細(xì)胞周期的影響Fig 2 FCM analysis of cell cycle in C2C12 cells infected by LV-ATF4 with BMP2 treatment

圖3 FCM 檢測(cè)各組C2C12 細(xì)胞凋亡的結(jié)果Fig 3 FCM analysis of apoptosis rate in C2C12 cells

3 討論

骨缺損是當(dāng)前骨外科常見的問(wèn)題之一。構(gòu)建活性人工骨修復(fù)材料為骨缺損的修復(fù)提供了方向，有研究表明在BMP2 誘導(dǎo)下C2C12 細(xì)胞可以向成骨細(xì)胞分化［11］。BMP2 在促進(jìn)骨形成過(guò)程中伴隨著復(fù)雜的分子生物學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制，而ATF4 在其中的作用罕有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP2 誘導(dǎo)C2C12 成骨分化過(guò)程中，加入LV-ATF4 能抑制C2C12 細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期，從而抑制細(xì)胞的增殖。在BMP2 誘導(dǎo)C2C12 成骨分化過(guò)程中，LV-ATF4 促進(jìn)C2C12 細(xì)胞的凋亡，各凋亡相關(guān)基因cleaved casepase-3、Chop和p-JNK 的表達(dá)也明顯上調(diào)。這是由于BMP2 在誘導(dǎo)軟骨、成骨細(xì)胞分化時(shí)會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［12］，這時(shí)加入ATF4 重組慢病毒處理，會(huì)進(jìn)一步激活凋亡相關(guān)基因cleaved casepase-3、Chop 和p-JNK 的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)凋亡小體的形成，進(jìn)而促進(jìn)C2C12 細(xì)胞的凋亡，ATF4 這一生物學(xué)作用可能對(duì)BMP2 誘導(dǎo)C2C12 成骨細(xì)胞分化造成一定影響。

圖4 蛋白質(zhì)印跡監(jiān)測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)Fig 4 Western blot analysis of expression of ER stress-mediated apoptosis related protein

圖5 透射電鏡檢測(cè)各組C2C12 細(xì)胞的凋亡Fig 5 Analysis of apoptosis in different C2C12 cell groups detected by transmission electron microscope(scale bar=2 μm)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了LV-ATF4 慢病毒，研究ATF4 在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的作用。在體外實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)在BMP2誘導(dǎo)C2C12 成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，ATF4 能夠通過(guò)減少S 期DNA 合成期細(xì)胞，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本研究為進(jìn)一步探討ATF4 在成骨細(xì)胞分化中的生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)，也為臨床骨相關(guān)疾病的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)參考價(jià)值。

［1］劉寶琴，王華芹.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與未折疊蛋白反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.中華腫瘤防治雜志，2010，17:869-872.

［2］Maedler K，Schulthess FT，Bielman C，et al.Glucose and leptin induce apoptosis in human beta-cells and impair glucose-stimulated insulin secretion through activation of c-Jun N-terminal kinases［J］.FASEB J，2008，22:1905-1913.

［3］Price J，Zaidi AK，Bohensky J，et al.Akt-1 mediates survival of chondrocytes from endoplasmic reticulum-induced stress［J］.J Cell Physiol，2010，222:502-508.

［4］Hotamisligil GS.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease［J］.Cell，2010，140:900-917.

［5］賈小婷，尹江，鄭國(guó)沛，等.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)乳腺癌細(xì)胞5-FU 化療敏感性影響的觀察［J］.中華腫瘤防治雜志，2013:1212-1216，1224.

［6］史晨輝，王維山，李長(zhǎng)俊，等.慢病毒介導(dǎo)uPA-siRNA重組表達(dá)載體的構(gòu)建及促進(jìn)兔軟骨細(xì)胞增殖［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2014，34:602-609.

［7］朱華宇，張翔，張曉，等.miR-203 真核表達(dá)載體的構(gòu)建和重組慢病毒的制備及其對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2013，29:589-592.

［8］許朝，胡端敏，諸琦.EEF1A2 基因慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的建立［J］.生物學(xué)雜志，2013，30:18-22.

［9］李巧轉(zhuǎn)，王婭蘭，李嫻.慢病毒PARG-shRNA 轉(zhuǎn)染降低大腸癌lovo 細(xì)胞基質(zhì)黏附、運(yùn)動(dòng)和侵襲能力［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30:237-241.

［10］韓騰龍，王立峰，張璟，等.pWPT-GFP 慢病毒載體的改構(gòu)及鑒定［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10:447-449.

［11］高艷，程晨，李靜，等.骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 誘導(dǎo)C2C12和MC3T3-E1 的成骨分化與自噬［J］.中國(guó)組織工程研究，2014，18:3236-3241.

［12］Han X，Zhang P，Jiang R，et al.Explore on the effect of ATF6 on cell growth and apoptosis in cartilage development［J］.Histochem Cell Biol，2014，142:497-509.