楊 蕾，李 蓉，李 岱，敬媛媛，楊 利，陶安陽，周慶菊，趙紅燕

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內分泌科，重慶400016)

肥胖相關的慢性低度炎性反應是胰島素抵抗發(fā)生的重要機制之一，在胰島素抵抗相關代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［1］。肥胖時體內飽和游離脂肪酸水平明顯升高，升高的游離脂肪酸通過激活MAPK 和NF-κB 等炎性反應通路導致脂肪組織炎性反應的發(fā)生［2］，同時促進巨噬細胞聚集到白色脂肪組織，維持和加重這種慢性炎性反應［3］。越來越多的證據證明，脂肪組織中的免疫細胞，特別是巨噬細胞，在調控肥胖相關的慢性低度炎性反應中發(fā)揮著關鍵性的作用［4］。

激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)作為能量感受器在調節(jié)細胞和機體能量平衡中發(fā)揮著重要的作用。研究表明AMPK活化能夠抑制脂肪酸、膽固醇的合成，增加脂肪酸的氧化、葡萄糖的轉運、線粒體的生物合成［5］，最近的研究報道激活AMPK 還可能產生抗炎，抗腫瘤等作用［6］。而二甲雙胍作為AMPK 的激動劑是否具有抗炎作用尚未有明確的報道。

因此，本研究擬以飽和脂肪酸刺激RAW264.7巨噬細胞，在體外建立一個代謝相關的炎性反應模型，初步探討二甲雙胍對巨噬細胞炎性反應的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RAW264.7 巨噬細胞系(ATCC 公司);飽和脂肪酸及二甲雙胍(Sigma 公司);Compound C(Calbiochem 公司);CCK-8 試劑盒(上海七海復泰生物科技有限公司);實時定量PCR 反轉錄及擴增試劑盒(TaKaRa 公司);ELISA 試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);小鼠AMPK 抗體及磷酸化AMPK(Thr 172)抗體(Cell Signaling 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組:RAW264.7 巨噬細胞用高糖DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/L 鏈霉素)于37 ℃、5% CO2的細

胞孵箱中培養(yǎng)。根據不同的干預藥物，將實驗分為4 組:正常對照組、飽和脂肪酸干預組、二甲雙胍+飽和脂肪酸干預組、10 μmol/L Compound C +二甲雙胍+飽和脂肪酸干預組。本實驗中飽和脂肪酸的干預濃度均為250 μmol/L，AMPK 抑制劑Compound C 于二甲雙胍及飽和脂肪酸干預前30 min 加入，24 h后收集細胞提取細胞RNA，收集細胞上清用于ELISA 檢測。所有實驗均獨立重復3 次。

1.2.2 CCK-8 法檢測二甲雙胍聯合飽和脂肪酸對RAW264.7 巨噬細胞增殖與毒性的影響:取對數期細胞，調整為5 ×104個/mL，每孔100 μL 接種于96孔板，分別以1 或2 mmol/L 二甲雙胍聯合飽和脂肪酸處理，每組設3 個副孔，具體操作步驟按照說明書進行。根據公式計算細胞存活率，細胞存活率(%)=［A(加藥)－A(空白)］/［A(正常細胞)－A(空白)］×100%。

1.2.3 實時定量PCR 檢測TNF-α 和IL-6 mRNA表達水平:采用Trizol 法提取出總RNA 后，反轉錄為cDNA，進行實時定量PCR 反應，具體操作步驟按照說明書進行，引物設計見表1。根據實時熒光定量擴增曲線測得目的基因及內參基因的Ct 值，目的基因的表達水平用β-actin 進行標準化，通過2－△△ct法分析。

表1 相關基因引物序列Table 1 Related gene primer sequences

1.2.4 ELISA 法檢測細胞上清中TNF-α 和IL-6 的分泌水平:收集干預好的細胞上清液于－20 ℃保存?zhèn)溆?，按照試劑盒說明書進行操作，最后根據測定的吸光度值，繪制標準曲線，計算待測因子濃度。

1.2.5 Western blot 法檢測AMPK 及p-AMPK 的表達:藥物干預RAW264.7 巨噬細胞60 min 后，提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，計算上樣量。配制12%的分離膠和4%的濃縮膠，每孔加入30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳分離后，轉膜90 min，5% BSA 封閉2 h，一抗(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜，ECL 試劑顯影及成像，AMPK 蛋白及p-AMPK(Thr 172)蛋白的表達結果以β-actin 作為內參照物，以吸光度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 二甲雙胍聯合飽和脂肪酸對RAW264.7 巨噬細胞增殖與毒性的影響

2 mmol/L 的二甲雙胍聯合飽和脂肪酸處理RAW264.7 巨噬細胞24 h 后，細胞的存活率均在95%以上(圖1)。因此，本研究選擇2 mmol/L 二甲雙胍作為后續(xù)實驗的藥物干預濃度。

圖1 不同濃度二甲雙胍聯合飽和脂肪酸對RAW2674.7 巨噬細胞存活率的影響Fig 1 Influence of different concentrations of metformin on RAW264.7 macrophage viability(±s，n=3)

2.2 二甲雙胍對飽和脂肪酸誘導的RAW264.7 巨噬細胞炎性因子mRNA 表達的影響

與對照組比較，飽和脂肪酸刺激RAW264.7 細胞24 h 后，TNF-α 及IL-6 的mRNA 表達水平均顯著升高(P＜0.05);與飽和脂肪酸組比較，二甲雙胍+飽和脂肪酸干預組TNF-α 及IL-6 的mRNA 表達水平均降低(P＜0.05);而加入AMPK 的抑制劑Compound C 后，二甲雙胍降低TNF-α 及IL-6 mRNA 表達的作用明顯減弱(P＜0.05)(圖2)。

圖2 二甲雙胍對飽和脂肪酸誘導的巨噬細胞炎性因子TNF-α 及IL-6 mRNA 表達的影響Fig 2 The impact of metformin on saturated fatty acidinduced macrophage inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 mRNA expression(±s，n=3)

2.3 二甲雙胍對飽和脂肪酸誘導的RAW264.7 巨噬細胞炎性因子分泌水平的影響

與對照組比較，飽和脂肪酸干預組細胞上清中TNF-α 和IL-6 的分泌量均升高(P＜0.05);與飽和脂肪酸組比較，加入二甲雙胍后TNF-α 和IL-6 的分泌水平均下降(P＜0.05);加入AMPK 的抑制劑Compound C 后，二甲雙胍降低飽和脂肪酸誘導的TNF-α及IL-6 分泌作用明顯減弱(P＜0.05)(圖3)。

2.4 二甲雙胍對RAW264.7 巨噬細胞AMPK 磷酸化水平的影響

與對照組比較，飽和脂肪酸干預細胞60 min 后AMPK 的磷酸化水平明顯減弱(P＜0.05);與正常組及飽和脂肪酸組比較，二甲雙胍+飽和脂肪酸干預細胞60 min 后AMPK 的磷酸化水平增強(P＜0.05)，加入Compound C 后，AMPK 的磷酸化水平降低(P＜0.05)(圖4)。

圖3 二甲雙胍對飽和脂肪酸誘導的巨噬細胞炎性因子TNF-α 及IL-6 蛋白分泌水平的影響Fig 3 The impact of metformin on saturated fatty acidinduced macrophage inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 protein level(±s，n=3)

3 討論

高脂飲食及靜坐的生活方式使肥胖的發(fā)病率逐年增加，肥胖相關的2 型糖尿病、心血管疾病給社會帶來了沉重的負擔。長期高脂飲食導致體內游離飽和脂肪酸升高，刺激以巨噬細胞為主的免疫細胞，激活多條炎性反應通路促使炎性因子TNF-α 和IL-6等的分泌［3］。長期高水平炎性因子誘導胰島素靶細胞產生胰島素抵抗，促使慢性炎性反應的發(fā)生發(fā)展［7］。本研究采用游離飽和脂肪酸刺激巨噬細胞，在體外建立代謝相關的炎性反應模型證實飽和脂肪酸刺激巨噬細胞后，炎性因子TNF-α 及IL-6 的分泌水平顯著升高。

圖4 二甲雙胍及飽和脂肪酸對巨噬細胞AMPK磷酸化水平的影響Fig 4 Effects of metformin and saturated fatty acids on macrophage AMPK phosphorylation level(±s，n=3)

近來，二甲雙胍的抗炎作用受到廣泛的關注。一些研究觀察到二甲雙胍對患者體內炎性標志物具有益影響，2 型糖尿病患者在二甲雙胍治療3 個月后，血清TNF-α 水平較治療前明顯降低，且這種效應與二甲雙胍的降糖作用無關［8-9］。另一些研究則認為，二甲雙胍對患者體內的炎性標志物沒有影響。在這些研究中，糖耐量受損患者或2 型糖尿病患者接受二甲雙胍治療16 周，患者血清中TNF-α 及CRP 的水平并沒有發(fā)生變化［10-11］。因此，二甲雙胍有無明確的抗炎效應有待進一步研究。本研究結果顯示，二甲雙胍能夠抑制飽和脂肪酸誘導的巨噬炎性因子TNF-α 及IL-6 的產生，這與采用細菌脂多糖建立體外急性炎性反應模型觀察二甲雙胍抗炎作用的結果一致［12］。

本研究進一步發(fā)現二甲雙胍增強巨噬細胞AMPK 的磷酸化水平，AMPK 的抑制劑Compound C使二甲雙胍增強AMPK 磷酸化的作用及抑制飽和脂肪酸誘導炎性因子分泌的作用減弱。這些結果提示，二甲雙胍通過活化AMPK 產生抗炎效應。二甲雙胍以一種AMPK 依賴的方式激活轉錄因子-3 進而減輕脂多糖誘導的巨噬細胞急性炎性反應［12］。近來有研究報道激活AMPK 能夠改變巨噬細胞的極化狀態(tài)，促使巨噬細胞活化為抗炎的細胞亞型［13］，這可能是二甲雙胍激活AMPK 產生抗炎作用的另一個機制。

綜上所述，本研究發(fā)現二甲雙胍活化AMPK 改善飽和脂肪酸誘導的巨噬細胞炎性反應。這提示二甲雙胍可能具有改善慢性炎性反應的作用，為臨床使用二甲雙胍治療肥胖相關的代謝性疾病提供了一些線索，但具體作用機制需要進一步研究。

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