劉 芳，黑常春，孔 斌，常 青*，鄭小敏，吳 凱，周文獻(xiàn)，朱萬平，趙承軍，3*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室寧夏生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川750004;2.陜西中醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，陜西西安712046;3.寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究中心，寧夏銀川750004)

伴隨生活節(jié)奏加快，工作壓力增加以及女性對自身生活質(zhì)量要求的提高，因卵巢因素而影響健康的問題已日益受到人們的重視。卵巢功能的突然減退導(dǎo)致嚴(yán)重的內(nèi)分泌和代謝紊亂，造成衰老、老年癡呆和骨質(zhì)疏松等，同時(shí)也給患者帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)。雌激素是一種類固醇激素，在女性體內(nèi)主要由卵巢分泌產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)雌激素不僅在女性生育能力、體內(nèi)水鈉代謝、心血管系統(tǒng)功能及骨代謝等方面發(fā)揮重要作用，而且能影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并具有重要的神經(jīng)保護(hù)作用［1］。雖然可以使用激素替代療法提高體內(nèi)雌性激素水平，但是存在效果不穩(wěn)定和不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)。卵巢移植有望成為克服卵巢衰竭患者神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂的有效方法。本實(shí)驗(yàn)通過去勢大鼠模型行卵巢移植，觀察內(nèi)源性雌激素釋放對去勢大鼠卵巢移植后海馬神經(jīng)元形態(tài)、尼氏體數(shù)量和雌激素膜性受體(G protein-coupled receptor 30，GPR30)表達(dá)變化的影響，以進(jìn)一步探討雌激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用，為卵巢移植的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雌性SD 大鼠54 只，12 周齡，體質(zhì)量300～350 g，新生3 d 內(nèi)雌性乳鼠24 只，體質(zhì)量20 g［寧夏醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物合格證號SCXK(寧)20050001)］;GPR30 抗體(Abcam 公司，ab39742);二步法免疫組織化學(xué)檢測試劑盒(北京中杉金橋公司);其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組和處理:將大鼠隨機(jī)分為對照組、卵巢去勢組和卵巢移植組，其中對照組大鼠6只，去勢組24 只，移植組24 只。24 只出生3 d 內(nèi)的雌性SD 乳鼠作為卵巢移植供體。去勢組大鼠按常規(guī)術(shù)式行卵巢切除。對照組大鼠行假手術(shù)，在卵巢旁進(jìn)行卵巢大小的脂肪切除。卵巢移植組大鼠于去勢7 d 后，在腎被膜下移植出生3日內(nèi)乳鼠卵巢。對照組只行假手術(shù)。上述各組于移植后7、14、21 和28 d 處死，取大腦，4%多聚甲醛固定組織用于形態(tài)學(xué)研究，新鮮腦組織剝離海馬，勻漿后提取總蛋白用于免疫印跡研究。

1.2.2 尼氏染色:固定后大腦，去除嗅球和后方的小腦，常規(guī)乙醇脫水石蠟包埋，連續(xù)切成5 μm 切片，間隔5 張取張切片，行10%甲苯胺藍(lán)染色顯示尼氏體。在高倍鏡下，每張切片顯微鏡下選取5 個(gè)不同視野進(jìn)行拍照。采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件，測量海馬神經(jīng)元內(nèi)尼氏體面積，用每個(gè)高倍視野下尼氏體的面積代表尼氏體的數(shù)量。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色檢測GPR30:石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滴加1 ∶500 PBS 稀釋的山羊抗鼠GPR30 抗體，陰性對照用PBS 代替一抗，4 ℃孵育過夜。復(fù)溫后，PBS 清洗后加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，PBS 清洗后DAB 顯色，脫水、透明、中性樹膠封片。在高倍鏡下，每張切片顯微鏡下選取5 個(gè)不同視野進(jìn)行拍照。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測量陽性細(xì)胞累積吸光度(IA)。

1.2.4 Western blot 檢測GPR30:每個(gè)蛋白樣品上樣約40 μg，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入1∶500 稀釋的GPR30 抗體，4 ℃孵育過夜。次日復(fù)溫、洗膜，1∶1 000 相應(yīng)二抗室溫孵育1 h后ECL 顯色。同一張膜上，相應(yīng)方法顯示內(nèi)參β-actin的條帶。Bio-Rad 顯色系統(tǒng)照相。用Image-J圖像分析軟件測量目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶的吸光度，用目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶的吸光度比值代表蛋白表達(dá)的相對量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)改變

對照組海馬形態(tài)正常，神經(jīng)元尼氏體豐富。去勢組隨去勢時(shí)間延長，海馬神經(jīng)元排列散亂，神經(jīng)元層數(shù)減少，胞體有皺縮，細(xì)胞核可見固縮深染。神經(jīng)元尼氏體數(shù)量減少，去勢28 d 時(shí)，為對照組的6%;卵巢移植組元隨著移植時(shí)間的延長，海馬神經(jīng)元形態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)并與正常形態(tài)接近，尼氏體數(shù)量逐漸增加，移植28 d 時(shí)，達(dá)到對照組的80%(圖1)。

2.2 GPR30 免疫組織化學(xué)染色

與對照組比較，去勢組GPR30 的表達(dá)隨著去勢時(shí)間延長在各區(qū)均有所下降，去勢28 d 時(shí)，表達(dá)量下降到對照組的1.8%。卵巢移植組隨著移植時(shí)間的延長，GPR30 的表達(dá)量有逐步回升的趨勢，移植28 d 時(shí)，達(dá)到對照組的83%(圖2)。

2.3 GPR30 免疫印跡結(jié)果

與對照組相比，去勢組GPR30 蛋白表達(dá)隨去勢時(shí)間的延長逐漸減少，去勢28 d 時(shí)，下降到對照組的42%;卵巢移植組GPR30 蛋白表達(dá)隨移植時(shí)間的延長逐漸增多，移植28 d 時(shí)達(dá)到對照組的88%(圖3)。

3 討論

雌激素對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有重要作用［2］，海馬具有調(diào)節(jié)情緒、參與學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知等功能，雌激素通過其受體，調(diào)節(jié)海馬神經(jīng)元的突觸可塑性并影響認(rèn)知行為［3］。

神經(jīng)元內(nèi)尼氏體參與合成影響神經(jīng)元功能的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)，尼氏體的變化可作為觀察神經(jīng)元受損的主要指標(biāo)［4］。出生3 d 內(nèi)的乳鼠，其卵巢為原始卵泡，抗原性低，對缺血缺氧不敏感，易成活，是移植的理想供體，腎臟因血供豐富并且是一個(gè)免疫缺陷區(qū)而有利于移植卵巢的存活和卵泡發(fā)育，因此采用在腎被膜下移植新生乳鼠卵巢的手術(shù)方式［5-6］。

圖1 各組海馬神經(jīng)元形態(tài)和尼氏體面積變化Fig 1 The changes of structures and area of Nissl bodies of hippocampus neurons in three groups(scale bar=50 μm)

圖2 各組海馬神經(jīng)元GPR30 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果Fig 2 The results of immunohistochemistry of hippocampus GPR30 in three groups(scale bar=50 μm)

本研究發(fā)現(xiàn)，去勢后海馬神經(jīng)元形態(tài)破壞，卵巢移植后得到一定恢復(fù)。但是移植7 d 組的神經(jīng)元形態(tài)恢復(fù)不明顯，與去勢7 d 組相比無差異，這可能與移植物在移植7 d 后才能建立良好有效的血液循環(huán)有關(guān)［7］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)［8-9］顯示，卵巢去勢后，雌激素水平迅速下降，7 d 為對照組的1/12 左右，28 d 雌激素水平接近0;卵巢移植后血清雌激素較孕酮水平升高更顯著。提示卵巢移植后，雌激素在神經(jīng)元的存活及功能維持中發(fā)揮了作用。

雌激素膜受體GPR30 是蛋白耦聯(lián)受體超家族的一員，主要分布于下丘腦-垂體軸、海馬和腦干等部位。對大鼠海馬內(nèi)GPR30 的原位雜交和免疫組化研究，發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞中有GPR30 的mRNA 和蛋白水平的表達(dá)［10-11］。生后雌性大鼠海馬內(nèi)GPR30 表達(dá)水平呈遞增趨勢并最終遍布整個(gè)海馬，進(jìn)而推測GPR30 可能參與了雌激素對海馬錐體層神經(jīng)元突觸可塑性的調(diào)節(jié)并影響學(xué)習(xí)記憶等功能［12-13］。在本實(shí)驗(yàn)中，GPR30 隨著去勢時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸減少，移植組中則隨著移植時(shí)間的逐漸延長而升高，并且兩者都存在明顯的雌激素水平依從性，至移植28 d 時(shí)與對照組無差異，隨著移植時(shí)間的進(jìn)一步延長，這種差異可能逐漸消失。

以上實(shí)驗(yàn)均提示，GPR30 參與雌激素對海馬錐體層神經(jīng)元突觸可塑性的調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮相應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用。雌激素如何通過雌激素-膜受體GPR30 介導(dǎo)海馬神經(jīng)元保護(hù)的機(jī)制還需做進(jìn)一步的研究。

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