楊文旭，潘 虹

(北京大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心，北京100034)

細(xì)胞周期依賴性激酶樣5 蛋白 (cyclin-dependent kinase-like 5，CDKL5)是絲氨酸/蘇氨酸激酶9，近年發(fā)現(xiàn)其編碼基因突變是引起不典型Rett 綜合征(Rett syndrome，RTT)中的早發(fā)驚厥型的主要原因，約占50%以上［1］。RTT 是一種X連鎖的主要累及女性并引起嚴(yán)重智力障礙的發(fā)育性神經(jīng)遺傳病。典型RTT 的主要致病基因是甲基化CpG 結(jié)合蛋白2 基因(methyl-CpG-binding protein 2，MECP2)。由于CDKL5 和MECP2 突變能引起相似的表型，如精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯、手刻板動(dòng)作和語(yǔ)言障礙等提示它們可能通過(guò)相同的分子通路發(fā)揮作用。

已確定的MeCP2 調(diào)控的下游靶基因包括NMDA 受體［2］、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain devired neurophic factor，BDNF)［3］等。其中BDNF 表達(dá)量受MeCP2 磷酸化動(dòng)態(tài)修飾調(diào)節(jié)的過(guò)程已經(jīng)明確［4］。BDNF 是一種促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)因子，它廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在維持突觸間信息傳遞以及突觸可塑性等方面具有重要意義［5］。目前CDKL5的下游靶基因及協(xié)同蛋白研究較少，鼠模型中確認(rèn)的只有神經(jīng)元突觸囊泡蛋白-1(amphiphysin1，Amph1)［6］和突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density protein-95，Psd95)［7］。鑒于兩基因變異造成重疊的臨床表現(xiàn)，提示CDKL5 與MeCP2 可能通過(guò)相同通路實(shí)現(xiàn)其在神經(jīng)元內(nèi)的功能。此外，由于CDKL5 缺乏可以導(dǎo)致神經(jīng)元形態(tài)異常［8］，提示CDKL5 可能與凋亡相應(yīng)通路息息相關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)用體外培養(yǎng)的孕18d 胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，使用siRNA 技術(shù)敲低Cdkl5 從而建立穩(wěn)定的體外模型，通過(guò)real-time PCR、Western blot、CCK8 實(shí)驗(yàn)分析該模型下游相關(guān)靶基因變化以及轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元的活力以及凋亡狀態(tài)。旨在為研究Cdkl5 的作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)孕齡18 d SD 胎鼠由北京維通利華公司提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)同意，倫理編號(hào):J201438。

1.1.2 藥物及試劑:DMEM 培養(yǎng)基、Neurobasal 培養(yǎng)基、B-27、0.25%胰蛋白酶、L-谷氨酸鹽和胎牛血清(Gibco 公司)，多聚賴氨酸(Sigma 公司)，Trizol(Ambion 公司)，RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life 公司)SYBR? Green PCR 混合物(AB Applied Biosystems公司)，CDKL5 多克隆抗體、Mecp2 單克隆抗體和GAPDH 單克隆抗體(Abcam 公司)，cleaved caspase-3 多克隆抗體(Millipore 公司)，兔抗鼠IgG 二抗和鼠抗兔IgG 二抗(Santa Cruz 公司)，化學(xué)發(fā)光劑(Thermo 公司)，CCK-8(Dojindo 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)方法如前述［9］。用0.25%胰蛋白酶于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化摘取的胎鼠大腦皮質(zhì)灰質(zhì)部分。用DMEM 加10%胎牛血清終止消化并反復(fù)吹打致使神經(jīng)元脫落。靜置細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，按106個(gè)/孔接種于多聚賴氨酸包被過(guò)夜的培養(yǎng)皿。待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基為Neurobasal 復(fù)合培養(yǎng)液(2%B27 和1% GLU)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建的帶GFP標(biāo)簽shRNA 慢病毒用于敲低Cdkl5。慢病毒中以鼠源Cdkl5 為靶基因的目標(biāo)序列是shRNA1(5'-GC AAAGATCTCACAAACAA-3')和shRNA2(5'-GCCGT TAACAGCTCAACAA-3')。按說(shuō)明書(shū)于神經(jīng)元體外培養(yǎng)活性較好的第7 天分別轉(zhuǎn)染目的慢病毒和對(duì)照病毒，感染復(fù)數(shù)為9。

1.2.3 Real time PCR:Trizol 提取培養(yǎng)神經(jīng)元RNA，按反轉(zhuǎn)錄劑盒說(shuō)明合成高質(zhì)量的cDNA，并進(jìn)行SYBR Green real-time PCR。結(jié)果以2－△△CT方法分析。所有引物序列如表1。

1.2.4 Western blot 蛋白質(zhì)印跡:10% 或者12%SDS-PAGE 分離蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入TBST 稀釋的1∶500 一抗Cdkl5多克隆抗體、1∶1 000 的Mecp2 單克隆抗體、1∶500的cleaved caspase-3 多克隆抗體、1∶5 000 的二抗小鼠抗兔IgG 或1 ∶5 000 的兔抗小鼠IgG 室溫孵育1 h。ECL 顯色液顯色，膠片曝光后通過(guò)Image J 分析目的條帶吸光度值。

1.2.5 CCK8 法:利用WST-8 法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定450nm 吸光度值A(chǔ) 值(absorbance value，A value)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證Cdkl5 敲低效率

體外培養(yǎng)的神經(jīng)元分別轉(zhuǎn)染shRNA1、shRNA2和對(duì)照病毒。隨著感染時(shí)間增加，Cdkl5 的敲低效率逐漸增加。轉(zhuǎn)染6 d 后神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的空泡，狀態(tài)較差，據(jù)此，選取轉(zhuǎn)染后5 d(即DIV12)作為實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間點(diǎn)。在mRNA 水平，shRNA1 和shRNA2敲低Cdkl5 的效率分別是65%和73% (圖1A);在蛋白水平，shRNA1 和shRNA2 敲低Cdkl5 的效率分別是35%和75% (圖1B，C)。因此，選擇shRNA2作為敲低Cdkl5 的有效shRNA。

2.2 神經(jīng)元內(nèi)Cdkl5 敲低后Mecp2 的變化

培養(yǎng)神經(jīng)元通過(guò)有效shRNA 敲低Cdkl5 以后，Mecp2 在mRNA 和蛋白水平的表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)(圖2，表2)。

2.3 Cdkl5 敲低后對(duì)Mecp2 及其本身下游靶基因的影響

相對(duì)于對(duì)照組，干擾組Psd95 升高，Bdnf 總轉(zhuǎn)錄體(Bdnf transcript Ⅺ)下降(P＜0.05)(圖3)。

2.4 Cdkl5 敲低對(duì)神經(jīng)元活性的影響

Cdkl5 敲低后細(xì)胞活性及凋亡狀態(tài)沒(méi)有明顯的變化(表3)。

表1 Real time PCR 引物Table 1 Primer sequences for real time PCR

圖1 原代皮質(zhì)神經(jīng)元Cdkl5 敲低效率Fig 1 The efficiency of silenced Cdkl5 in primary cortical neurons

圖2 Cdkl5 敲低后Mecp2 的變化Fig 2 The effect of silenced Cdkl5 on the amounts of Mecp2

表2 Cdkl5 敲低神經(jīng)元中Mecp2 在mRNA 和蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量Table 2 Relative expression of Mecp2 on the level of mRNA and protein in Cdkl5-silenced neurons(±s，n=5)

表2 Cdkl5 敲低神經(jīng)元中Mecp2 在mRNA 和蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量Table 2 Relative expression of Mecp2 on the level of mRNA and protein in Cdkl5-silenced neurons(±s，n=5)

＊P＜0.05 compared with control shRNA group.

groupmRNAprotein control shRNA0.026 ±0.0040.305 ±0.270 Cdkl5 shRNA0.042 ±0.002*0.426 ±0.240*

圖3 Cdkl5 敲低后Mecp2 相關(guān)下游基因的變化Fig 3 The effect of silenced Cdkl5 on the Mecp2-related target genes(±s)

表3 Cdkl5 敲低對(duì)神經(jīng)元活力及凋亡狀態(tài)的影響Table 3 The effect of silenced Cdkl5 on the cell viability and cell apoptosis(±s，n=4)

表3 Cdkl5 敲低對(duì)神經(jīng)元活力及凋亡狀態(tài)的影響Table 3 The effect of silenced Cdkl5 on the cell viability and cell apoptosis(±s，n=4)

groupsA valuecaspase3cleaved-caspase3 control shRNA3.500 ±0.250 0.117 ±0.0210.278±0.056 Cdkl5 shRNA3.300 ±0.170 0.159 ±0.0640.289 ±0.092

3 討論

CDKL5 位于染色體Xp22，包含21 個(gè)外顯子。歸屬于脯氨酸亞家族，并和細(xì)胞周期依賴樣激酶同源，因此也被稱為絲氨酸/蘇氨酸激酶9。其蛋白在人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)，以大腦皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)為著。研究顯示CDKL5 減少會(huì)影響神經(jīng)元軸突、樹(shù)突形態(tài)生長(zhǎng)過(guò)程，最終導(dǎo)致突觸間信息傳遞異常［10］。關(guān)于MeCP2 與CDKL5 如何相互作用的研究較少。早期研究認(rèn)為CDKL5 對(duì)MeCP2 沒(méi)有行使特定位點(diǎn)的磷酸化功能［11］。但是，在鼠模型中敲低Mecp2 或者使用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑卻可以誘導(dǎo)Cdkl5 高表達(dá)［12］。鑒于兩基因突變引起互相重疊的臨床表現(xiàn)，本研究就這兩分子相互關(guān)系進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元Cdkl5 敲低后出現(xiàn)明顯的Mecp2 升高，這證實(shí)兩者在分子水平具有負(fù)性相關(guān)的關(guān)系，同時(shí)提示其下游可能存在共同通路。

本研究還顯示Cdkl5 敲低以后能誘發(fā)Bdnf 總轉(zhuǎn)錄體mRNA 下降。由于具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的Mecp2 可以通過(guò)活性依賴的磷酸化修飾調(diào)節(jié)Bdnf表達(dá)量［13］，因此推測(cè)Bdnf 總轉(zhuǎn)錄體mRNA 下降的現(xiàn)象可能是由于Cdkl5 敲低后出現(xiàn)的Mecp2 升高所致，這與Mecp2 和Bdnf 本身存在的負(fù)性調(diào)節(jié)關(guān)系相一致。Cdkl5 位于突觸的PSD 區(qū)域，提示Cdkl5 對(duì)興奮性突觸的重要性［7］。本研究發(fā)現(xiàn)Cdkl5 敲低的神經(jīng)元中出現(xiàn)Psd95 明顯表達(dá)上調(diào)，這與報(bào)道的結(jié)果［7］相反，可能是由研究對(duì)象及觀察時(shí)間點(diǎn)的不一致造成的。

以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示了Cdkl5 缺乏的小鼠神經(jīng)元表現(xiàn)不同程度的破壞性，如神經(jīng)元軸突樹(shù)突結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，神經(jīng)元活性降低等［7-8，14］，提示敲低Cdkl5 模型中存在凋亡現(xiàn)象。經(jīng)過(guò)細(xì)胞活性及凋亡基因的檢測(cè)，本研究只發(fā)現(xiàn)了符合細(xì)胞凋亡趨勢(shì)的輕微無(wú)顯著變化。這可能與鼠模型的Cdkl5 基因敲除程度有關(guān)。

本研究建立了穩(wěn)定的Cdkl5 敲低的神經(jīng)元模型，并初步提示Cdkl5 可能是通過(guò)對(duì)Mecp2 的調(diào)控誘導(dǎo)了下游靶基因的變化。目前關(guān)于Cdkl5 是否是Mecp2 的特異性磷酸化酶這個(gè)問(wèn)題存在爭(zhēng)議，且有研究報(bào)道Cdkl5 可能是通過(guò)磷酸化其他蛋白介導(dǎo)突觸形態(tài)變化［15］。另有研究報(bào)道Cdkl5 功能可能是通過(guò)棕櫚化其他蛋白實(shí)現(xiàn)的［10］。Cdkl5 與Mecp2究竟是否存在特定的關(guān)系從而影響功能、Cdkl5 與Mecp2 究竟如何引起表型的重疊以及差異尚需進(jìn)一步的深入研究。

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