侯思慧，李青嶺，胡 筠，彭 洪，郭進(jìn)軍*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶400010;2.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，重慶400016)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起中國(guó)近10%的感染率［1］。慢性HBV 感染的臨床表現(xiàn)和轉(zhuǎn)歸顯著異質(zhì)化，約半數(shù)以上患者病情穩(wěn)定，表現(xiàn)為無(wú)癥狀攜帶或輕度慢性肝炎;部分患者則預(yù)后不良，可進(jìn)展為肝硬化或肝癌等終末期肝?。?］。HBV感染的不同結(jié)局通常歸因?yàn)樗拗?、病毒自身及環(huán)境3 大因素，越來(lái)越多的證據(jù)表明宿主遺傳因素在HBV 感染中發(fā)揮了舉足輕重的作用［3-5］。

人類白細(xì)胞抗原(HLA)在調(diào)節(jié)HBV 感染的免疫應(yīng)答和臨床轉(zhuǎn)歸上起到了重要作用［6-8］。近來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)分析表明在日本人中HLA-DQ rs9275572 與丙肝相關(guān)肝癌發(fā)生密切相關(guān)［9］。隨后，研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQ rs9275319 影響乙肝相關(guān)肝癌的發(fā)生［10］。因此，本研究通過(guò)病例-對(duì)照方法來(lái)探討HLA-DQ 基因多態(tài)性(rs9275572 和rs9275319)與乙型肝炎病毒感染結(jié)局的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集從2011年1月至2014年6月門(mén)診就診于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院及附屬第二醫(yī)院的310名HBV 相關(guān)慢性肝病者(CLD)，其中CLD 包括慢性乙型肝炎(CHB)、乙肝肝硬化(LC)、乙肝肝癌(HCC)。同時(shí)收集在體檢科進(jìn)行健康查體的295名HBV 自發(fā)清除者(SC)及316 名健康對(duì)照者(HC)。所有受試者均無(wú)血緣關(guān)系。在樣本收集中，無(wú)性別、年齡限制。各組納入標(biāo)準(zhǔn)參照表1。

具備下列之一須排除:1)HIV 或非HBV 肝炎病毒感染者;2)乙肝兩對(duì)半不明確;3)僅有HBsAb(+)的疫苗接種者;4)其他肝臟疾病:如自身免疫型肝病，毒性因素所致的肝病等;5)嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等;6)非漢族人。本研究通過(guò)了重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且所有的受試者均簽署了以赫爾辛基宣言為基礎(chǔ)的書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 樣本采集及生化酶學(xué)指標(biāo)

采集每個(gè)受試者血液3～5 mL，于－80 ℃保存以備用。通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查記錄其年齡、性別、飲酒和吸煙等基本情況。兩對(duì)半、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清總膽紅素(T-Bil)及HBV-DNA 的測(cè)定由本醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

表1 各組篩選標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Diagnosis criteria for all groups

1.3 基因組DNA 的提取及基因分型

外周血基因組DNA 的提取按照Wizard? Genomic DNA 純化試劑盒(Promega 公司)說(shuō)明完成。NanoDrop 2000 (Thermo Scientific 公司)測(cè)定DNA濃度，并稀釋成20 ng/μL備用。

單核甘酸多態(tài)性(SNP)rs9275572 和rs9275319分型采用TaqMan 探針?lè)?Applied Biosystems 公司)。TaqMan 等位基因鑒別實(shí)驗(yàn)由ABI 7500 fast real-time PCR system 完成(Applied Biosystems 公司)，其中每96 孔設(shè)置1 個(gè)陰性對(duì)照和1 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，含20 ng/μL DNA 2 μL，master mix 10 μL，primer-probe mix 0.5 μL 及DNAase-free water 7.5 μL。PCR 反應(yīng)條件參照TaqMan 探針說(shuō)明書(shū)。為保證分型準(zhǔn)確，隨機(jī)選取5%樣本用同一方法重復(fù)驗(yàn)證，基因分型錯(cuò)誤率小于＜0.1%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析由SPSS19.0 軟件完成。Student t 檢驗(yàn)或Mann-Whitney U 檢驗(yàn)用于計(jì)量資料的比較;χ2檢驗(yàn)用于計(jì)數(shù)資料比較;二分類logic 回歸校正年齡性別后比較基因型及基因模型在各組中的差異。Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡由Stata 20.0 軟件完成。單體型分析由Haploview software (v4.2)軟件完成。所有檢驗(yàn)P 值均為雙側(cè)。

2 結(jié)果

2.1 基本資料及Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡

2.1.1 基本資料:在男性，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、膽紅素(T-Bil)、HBV-DNA 定量上，CLD 組顯著高于SC 及HC 組(P＜0.001)(表2)。

2.1.2 Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡:rs9275572、rs9275319 均符合 H-W 遺傳平衡(CLD 組:rs9275572 位點(diǎn)P = 0.158，rs9275319 位點(diǎn)P =0.285;SC 組:rs9275572 位點(diǎn)P =0.729，rs9275319位點(diǎn)P =0.182;HC 組:rs9275572 位點(diǎn)P =0.513，rs9275319 位點(diǎn)P=0.238)。

2.2 HLA-DQ rs9275572 基因型與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系

rs9275572 GG 型是各組中最常見(jiàn)基因型。攜帶rs9275572 AG 基因型有利于感染后病毒的自發(fā)清除，這種保護(hù)性作用在顯性遺傳模型中仍存在(基因型:OR 1.82;95% CI 1.26～2.62，校正后P＜0.001;顯性模型:OR 1.84;95% CI 1.30～2.61，校正后P＜0.001)(表3)。

2.3 HLA-DQ rs9275319 基因型與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系

攜帶rs9275319 TC 型降低了乙肝感染的風(fēng)險(xiǎn)(CLD vs HC:基因型:OR 0.48;95% CI 0.31～0.76;顯性模型:OR 0.47;95% CI 0.31～0.72)。盡管其3 種基因型在探討乙肝病毒感染后自發(fā)清除方面未表現(xiàn)出相關(guān)性，但對(duì)等位基因頻率及顯性模型分析時(shí)發(fā)現(xiàn)C 等位基因及TC+CC 型有利于病毒感染后清除(等位基因:OR 1.61;95% CI 1.06～2.43;顯性模型:OR 1.57;95% CI，1.01～2.48)(表3)。

2.4 HLA-DQ 基因單體型與乙肝病毒感染結(jié)局的關(guān)系

考慮到單體型在解釋多態(tài)性與疾病相關(guān)性上有更好的說(shuō)服力，本研究以HLA-DQ 兩位點(diǎn)為基礎(chǔ)構(gòu)建單體型，兩位點(diǎn)連鎖不平衡(圖1)。單體型T-G和T-A 與乙肝易感性及乙肝病毒感染后自發(fā)清除有關(guān)(CLD vs HC:單體型T-G P＜0.01/單體型T-A P＜0.05 ;CLD vs SC:單體型T-G P＜0.001/單體型T-A P＜0.01)。在疾病進(jìn)展方面，未發(fā)現(xiàn)與其有關(guān)的單體型(表4)。

表2 納入研究者的人口學(xué)及臨床特征Table 2 Demographic and clinical characteristics of the subjects enrolled in the study

3 討論

圖1 HLA-DQ 基因兩位點(diǎn)連鎖不平衡Fig 1 Linkage disequilibrium (LD)of the two SNPs in HLA-DQ gene

表3 HLA-DQ 基因型與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系Table 3 Effects of HLA-DQ genotypes on HBV infection outcomes

表4 HLA-DQ 單體型與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系Table 4 Association of HLA-DQ Haplotypes with the outcomes of HBV infection

人類白細(xì)胞抗原(HLA)作為人類復(fù)雜性最高的基因，在病毒感染性疾病中起重要作用［9-12］。HLA位于第6 號(hào)染色體短臂(6p21.3)，長(zhǎng)約4 Mb，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類基因，其中HLA-DQ 作為Ⅱ類基因，由34 ku α 鏈和28 ku β 鏈非共價(jià)結(jié)合而成，主要通過(guò)CD4+T 細(xì)胞識(shí)別HLA-Ⅱ類分子呈遞的抗原肽復(fù)合物，從而激活抗原特異性B 細(xì)胞及細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(CTL)，參與抗HBV 的免疫應(yīng)答［13］。rs9275572位于HLA-DQA 和HLA-DQB 基因間，以參考文獻(xiàn)［9］研究為基礎(chǔ)，同時(shí)考慮到乙肝病毒與丙肝病毒感染后引起類似免疫反應(yīng)機(jī)制，許多與丙肝有關(guān)的基因多態(tài)性位點(diǎn)經(jīng)研究在乙肝免疫反應(yīng)中同樣起作用［11，14］，本研究試圖探索rs9275572 是否與乙肝感染結(jié)局存在相關(guān)性。令人興奮的是，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶rs9275572 AG +AA 基因型有利于感染后病毒的自發(fā)清除，其得到了同一時(shí)段內(nèi)其他相關(guān)研究的支持［6-7］。HLA-DQ rs9275319 相距rs9275572 約12 kb，本研究發(fā)現(xiàn)rs9275319 C 等位基因可減少HBV感染，其與Jiang DK 等［10］全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)一致，另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)為攜帶rs9275319 TC +CC 型有利于病毒感染后自發(fā)清除。兩位點(diǎn)單倍體分析進(jìn)一步佐證了上述觀點(diǎn)。

本研究將rs9275572 與rs9275319 結(jié)合探討HLA-DQ 基因多態(tài)性與乙肝感染結(jié)局的關(guān)系。然而，對(duì)于rs9275572 來(lái)說(shuō)，本研究較之其他研究仍有相悖之處，2011年GWAS 研究結(jié)果表明其對(duì)HCV-肝癌有影響［9］，而在本實(shí)驗(yàn)中未能發(fā)現(xiàn)其與乙肝疾病進(jìn)展的關(guān)系，考慮存在以下原因:1)雖然在免疫反應(yīng)及臨床表現(xiàn)上乙肝與丙肝類似，但乙肝病毒是dsDNA 病毒，而丙肝病毒是單股正鏈RNA 病毒，有研究表明在雙重感染中，HBV 和HCV 有相互抑制的趨勢(shì)［15］，這可能會(huì)導(dǎo)致rs9275572 位點(diǎn)在乙肝肝癌和丙肝肝癌研究中的差異。2)SNP 在不同人種、不同區(qū)域遺傳差異顯著，這也是導(dǎo)致該研究與其他研究差異的一個(gè)原因。本研究也存在一定的不足之處，即納入研究的樣本數(shù)目不夠大，尤其在探討疾病進(jìn)展方面，這在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)信度。今后需要樣本更大、設(shè)計(jì)更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本發(fā)現(xiàn)。總之，本研究表明中國(guó)人HLA-DQ 基因多態(tài)性與乙肝易感性及感染后病毒自發(fā)清除有關(guān)，這在一定程度上為慢性乙型肝炎的早預(yù)防和高應(yīng)答率治療奠定了些許基礎(chǔ)。

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