宗麗菊，王 頡，劉洪麗，馮進(jìn)波，張友忠

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟(jì)南250012)

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見的3 大惡性腫瘤之一。目前，早期子宮內(nèi)膜癌患者保留生育功能的治療方法主要有孕激素和子宮內(nèi)膜去除術(shù)［1］。光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)利用光敏劑和激發(fā)光源靶向治療腫瘤，成為繼手術(shù)、放化療之后的新的微創(chuàng)療法［2］。PDT 已用于治療皮膚癌、肺癌、宮頸癌、早期食管癌等［3］。本研究以子宮內(nèi)膜高分化腺癌Ishikawa 細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察以水溶性陽離子卟啉化合物四甲基吡啶卟啉［5，10，15，20-Tetrakis(1-methylpyridinium-4-yl)porphyrin，TMPyP］為光敏劑的PDT 對(duì)其細(xì)胞周期和凋亡的影響，以及對(duì)Bcl-2 蛋白和核因子-κB P65(nuclear factor kappa B，NF-κB P65)的影響，為早期子宮內(nèi)膜癌患者的保守治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系Ishikawa 細(xì)胞(ATCC 細(xì)胞庫)。

1.1.2 主要試劑:光敏劑TMPyP(Sigma-Aldrich 公司)，胎牛血清及DMEM 培養(yǎng)液(Gibco 公司)，細(xì)胞活力、細(xì)胞周期和凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物)，NF-κB P65、磷酸化NF-κB P65(phospho-NF-κB P65，p-NF-κB P65)、Bcl-2 單克隆抗體(CST 公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Abcam 公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):在37 ℃、濕度飽和、5% CO2孵箱中用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞，2～3 d 傳代1 次，實(shí)驗(yàn)用對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞。

1.2.2 PDT 處理細(xì)胞:將TMPyP 配置成60 μmol/L的儲(chǔ)存液，使用前用DMEM 培養(yǎng)液稀釋成工作液。棄去細(xì)胞原培養(yǎng)基，加入目的濃度的TMPyP 工作液，避光孵育4～6 h 后進(jìn)行激光照射。光照條件:波長(470 ±10)nm，根據(jù)目的激光能量密度調(diào)整功率0.2～0.8 W，光照60 s。光照后加入完全培養(yǎng)液。對(duì)照組不加光敏劑，不進(jìn)行光照，其他條件同實(shí)驗(yàn)組。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:倒置相差顯微鏡下觀察PDT 組(TMPyP 濃度0.6 μmol/L，能量密度4.8 J/cm2)1 和12 h 細(xì)胞形態(tài)并拍照采集圖像。

1.2.4 光敏劑的熒光檢測:將Ishikawa 細(xì)胞接種于鋪有蓋玻片的24 孔板，制備細(xì)胞爬片，設(shè)置對(duì)照組和PDT 組(TMPyP 濃度0.6 μmol/L，能量密度4.8 J/cm2)，處理4 h 后，漂洗，固定，在熒光顯微鏡紫外UV 模式(激發(fā)波長330～380 nm，發(fā)射波長460～520 nm)下觀察。

1.2.5 細(xì)胞存活率的檢測:制備Ishikawa 單細(xì)胞懸液接種于96 孔板中，24 h 后PDT 處理細(xì)胞。PDT 分為兩大組:一組激光能量密度為4.8 J/cm2，TMPyP 濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、1.2 和1.8 μmol/L;另一組TMPyP 濃度為0.6 μmol/L，激光能量密度分別為0、2.4、3.6、4.8、6.0 和7.2 J/cm2。PDT 處理24 h后，按CCK-8 試劑盒說明書操作，測定吸光度A 值。每組設(shè)3 個(gè)副孔，重復(fù)3 次。細(xì)胞存活率(100%)=(實(shí)驗(yàn)組A 值－空白組A 值)/(對(duì)照組A 值－空白組A 值)×100%。

1.2.6 細(xì)胞周期的檢測:將Ishikawa 細(xì)胞接種于6孔板中，匯合度為50%～80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為對(duì)照組和PDT 組(TMPyP 濃度0.6 μmol/L，能量密度4.8 J/cm2)。PDT 處理細(xì)胞12 和24 h 后，按周期檢測試劑盒說明書操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用ModFit 軟件分析結(jié)果。

1.2.7 細(xì)胞凋亡率的檢測:將Ishikawa 細(xì)胞接種于6 孔板，匯合度為80%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組同細(xì)胞周期檢測。PDT 處理細(xì)胞12 和24 h 后，按凋亡檢測試劑盒說明書操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用FlowJo_V10 分析結(jié)果。

1.2.8 Western blot 檢測目的蛋白:提取對(duì)照組、PDT組(TMPyP 濃度0.6 μmol/L，能量密度4.8 J/cm2)處理12 和24 h 的細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度。取50 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，用NF-κB P65、p-NF-κB P65、Bcl-2 和GAPDH 一抗(1 ∶500～1∶2 000稀釋)孵育;二抗(1 ∶5 000 稀釋)孵育，洗膜，曝光顯影。Image-J 分析信號(hào)灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0 軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用q 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PDT 改變Ishikawa 細(xì)胞的形態(tài)

對(duì)照組的細(xì)胞分布均勻，貼壁緊密，成梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻，邊界清楚(圖1A)。PDT 處理細(xì)胞4 h 后，細(xì)胞變圓、皺縮，間隙增大，胞質(zhì)出現(xiàn)小泡，呈早期凋亡樣改變(圖1B)。處理12 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞失去原有形態(tài)，胞質(zhì)不均勻，細(xì)胞核固縮、明顯 (圖1C)。TMPyP 在488 nm 波長的激發(fā)下可以發(fā)出紅光，在熒光顯微鏡UV 激發(fā)下，可見細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，主要分布于細(xì)胞核(圖1D)。

2.2 PDT 降低Ishikawa 細(xì)胞的活力

激光能量密度為4.8 J/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低(P＜0.05)，與光敏劑TMPyP 的濃度有關(guān)(圖2A)。TMPyP 濃度為0.6 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率與激光能量有關(guān)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率顯著下降(P＜0.05)(圖2B)。

圖2 不同TMPyP 濃度和激光能量下Ishikawa 細(xì)胞的存活率Fig 2 Survival rate of Ishikawa cell in different concentrations of TMPyP and energy(±s，n=3)

2.3 PDT 引起Ishikawa 細(xì)胞S 期阻滯

由于凋亡細(xì)胞產(chǎn)生DNA 片段，在G1峰前會(huì)出現(xiàn)亞G1峰(sub-G1)，為凋亡峰(圖3)。PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后細(xì)胞周期分布發(fā)生改變，可以誘導(dǎo)細(xì)胞S 期比例增高，引起S 期阻滯，并出現(xiàn)凋亡峰。與對(duì)照組相比，PDT 組sub-G1和S 期比例升高(P＜0.05)(表1)。

2.4 PDT 誘導(dǎo)Ishikawa 細(xì)胞凋亡

PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 h 后主要引起細(xì)胞早期凋亡，24 h 后引起早期凋亡、晚期凋亡及壞死。PDT 后12 和24 h 的凋亡率分別為19.04% ±1.60%和39.09%±3.41%，顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)(圖4)。

2.5 PDT 降低Ishikawa 細(xì)胞p-NF-κB P65 和Bcl-2蛋白的表達(dá)

PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后，p-NF-κB P65 蛋白的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，Bcl-2 蛋白的表達(dá)在處理24 h 后顯著降低(P＜0.05)(圖5，表2)。

圖3 PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞后細(xì)胞周期分布直方圖Fig 3 Histogram graphic of cell cycle analysis in Ishikawa cell treated by PDT

表1 PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后細(xì)胞周期的分布比例Table 1 Cell cycle distribution of Ishikawa cell after treatment for 12 and 24 hours with PDT(±s，%，n=3)

表1 PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后細(xì)胞周期的分布比例Table 1 Cell cycle distribution of Ishikawa cell after treatment for 12 and 24 hours with PDT(±s，%，n=3)

*P＜0.05 compared with control group.

groupsub-G1G0/G1SG 2 control0.20 ±0.2356.70 ±0.9621.8 8 ±0.8021.42 ±1.77 PDT 12 hours24.08 ±2.37*49.41 ±0.71*27.38 ±0.92*23.21 ±0.74 PDT 24 hours45.32 ±8.43*43.04 ±1.59*36.00 ±1.28*20.96 ±1.72

圖4 PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后的凋亡分析Fig 4 Analysis of apoptosis in Ishikawa cells treaed by PDT after 12 and 24 hours

圖5 PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后NF-κB P65、p-NF-κB P65 及Bcl-2 蛋白的表達(dá)Fig 5 Expression of NF-κB P65，p-NF-κB P65 and Bcl-2 protein in Ishikawa cells treated by PDT after 12 and 24 hours

表2 PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后NF-κB P65、p-NF-κB P65 及Bcl-2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量Table 2 Relative expression of NF-κB P65，p-NF-κB P65 and Bcl-2 protein in Ishikawa cells treated by PDT after 12 and 24 hours(±s，%，n=3)

表2 PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞12 和24 h 后NF-κB P65、p-NF-κB P65 及Bcl-2 蛋白的相對(duì)表達(dá)量Table 2 Relative expression of NF-κB P65，p-NF-κB P65 and Bcl-2 protein in Ishikawa cells treated by PDT after 12 and 24 hours(±s，%，n=3)

＊P＜0.05 compared with control group.

target protein target protein/GAPDH controlPDT 12 hoursPDT 24 hours NF-κ B P651.12 ±0.180.86 ±0.330.85 ±0.14 p-NF-κB P651.03 ±0.140.35 ±0.18*0.32 ±0.14*Bcl-20.91 ±0.090.99 ±0.120.50 ±0.08*

3 討論

早期子宮內(nèi)膜癌患者保留生育功能的治療方法受到越來越多的關(guān)注。PDT 作為一種新的微創(chuàng)療法，也逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，水溶性陽離子卟啉TMPyP 為光敏劑的PDT 對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞有抗腫瘤的效應(yīng)，可以抑制其增殖，誘導(dǎo)其凋亡并引起S 期阻滯。

NF-κB 是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期、增殖與凋亡［4］。NF-κB P65 是NF-κB 最重要的功能性亞單位，其磷酸化水平?jīng)Q定著NF-κB 的活性［5］。通過NF-κB P65 亞單位磷酸化水平可判斷NF-κB P65 的活性。而NF-κB 的活性在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生過程中起中心作用［6］。本研究發(fā)現(xiàn)PDT 降低Ishikawa 細(xì)胞NF-κB P65 的磷酸化水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，可促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制死亡，抑制Bcl-2 可增強(qiáng)腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性［7］。本研究發(fā)現(xiàn)PDT 處理Ishikawa 細(xì)胞24 h 后可以降低Bcl-2 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而NF-κB 的活性在PDT 處理12 h 即可顯著下降。在多種腫瘤細(xì)胞中NF-κB 與Bcl-2 相互調(diào)節(jié)［8］，NF-κB 的失活可以下調(diào)Bcl-2［9］。在黑色素細(xì)胞瘤中PDT 可通過NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)［10］。PDT 可能通過降低Ishikawa 細(xì)胞NF-κB 的活性進(jìn)而下調(diào)Bcl-2，影響細(xì)胞的周期和凋亡。臨床上，PDT 治療16 例有生育要求的年輕內(nèi)膜癌患者，可達(dá)75%的有效率，57%的妊娠率［11］。1 例低度惡性子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤的患者經(jīng)PDT 聯(lián)合手術(shù)治療成功受孕分娩［12］。

綜上所述，PDT 可以通過降低NF-κB 和Bcl-2的活性誘導(dǎo)Ishikawa 細(xì)胞的S 期阻滯和凋亡，為子宮內(nèi)膜癌患者保留生育功能的治療提供了新思路。

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