孫 輝,楊金奎,張克勤

(1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 農(nóng)學院，廣東 廣州 510225；2 云南大學 云南省生物資源保護與利用重點實驗室, 云南 昆明650091)

毛殼菌幾丁質(zhì)酶的酶學性質(zhì)及抑菌活性研究

孫 輝1,楊金奎2,張克勤2

(1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院 農(nóng)學院，廣東 廣州 510225；2 云南大學 云南省生物資源保護與利用重點實驗室, 云南 昆明650091)

【目的】 研究毛殼菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)產(chǎn)胞外幾丁質(zhì)酶的酶學性質(zhì)及抑菌活性，為幾丁質(zhì)酶的抑菌作用機理研究提供依據(jù)。【方法】 利用蛋白活性電泳方法純化幾丁質(zhì)酶液，測定幾丁質(zhì)酶的酶學性質(zhì)，并用酶液浸泡病原菌菌塊，研究酶液的抑菌活性?！窘Y(jié)果】 用蛋白活性電泳方法得到幾丁質(zhì)酶的純酶液，經(jīng)檢測為電泳純條帶，分子質(zhì)量為43 ku。毛殼菌幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，最適pH為6，40 ℃以下保溫30 min均能保持其初始活性，在pH 5～9保溫30 min仍舊具有較高的活性，Ca2+和Zn2+能明顯增強幾丁質(zhì)酶的活性，其純酶液能抑制立枯絲核菌和煙草赤星病菌的菌絲生長?！窘Y(jié)論】 毛殼菌幾丁質(zhì)酶在比較溫和的條件下能保持一定的活性，純酶液對部分病原真菌有較強的抑制作用。

毛殼菌；幾丁質(zhì)酶；酶學性質(zhì)；抑菌活性

隨著人們對環(huán)境和健康問題的日益關(guān)注，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物病害的防治方法正加緊由傳統(tǒng)的化學防治向生物防治發(fā)展轉(zhuǎn)變。生防真菌和植物病原真菌之間的互作一直是大量研究者最為關(guān)注的問題。由于菌絲在植物根圍具有更大的生長潛力以及可與寄主建立起多樣的作用方式，真菌作為生防菌較細菌具有更廣泛的擴展空間[1]。近年來，已有大量的真菌種類和分離物被作為生防因子用于生物防治，如木霉、粉紅粘帚霉、淡紫擬青霉等[2-4]。

毛殼菌作為一種新興的生防因子，也受到了越來越廣泛的關(guān)注。毛殼菌的生防機理主要包括重寄生作用、產(chǎn)生抗生物質(zhì)、酶降解作用等，其中酶對病原真菌細胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分發(fā)揮降解作用，尤其是真菌細胞壁的特征性成分幾丁質(zhì)[5]。在Soytong等[6]描述的球毛殼菌生物防治機制的相關(guān)因素中，幾丁質(zhì)酶作為單獨的一類重要因素在生防中發(fā)揮著重要作用。

本研究前期工作中分離得到1株具有較強抑菌活性的毛殼菌屬真菌。因此，為完善毛殼菌生物防治機制的相關(guān)背景，本研究對毛殼菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)胞外幾丁質(zhì)酶進行分離純化，并測定了其酶學性質(zhì)，同時對純酶的抑菌活性進行了初步測定，以期為幾丁質(zhì)酶的抑菌作用機理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 毛殼菌(Chaetomiumsp.YMF1.00843)，分離自土壤，初篩獲得產(chǎn)酶較高的菌株；立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、煙草赤星病菌(Alternariaalternate)，由云南大學微生物發(fā)酵重點實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 1)PDA培養(yǎng)基。去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，用于真菌的接種、保藏。2)WA培養(yǎng)基。1 L水加入20 g瓊脂，用于抑菌活性培養(yǎng)觀察。3)OL培養(yǎng)基。燕麥片1 g/L，幾丁質(zhì)粉0.5 g/L，明膠0.5 g/L，酵母粉1 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO41 g/L，無機鹽溶液50 mL(無機鹽成分：K2HPO420 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，NaCl 2 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO40.1 g/L，ZnSO40.1 g/L)，加水補充體積至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.0，分裝于250 mL三角瓶，每瓶100 mL。分別于121 ℃高溫高壓濕熱滅菌20 min，用于供試菌株的培養(yǎng)及胞外酶的獲取。

1.2 方 法

1.2.1 幾丁質(zhì)酶的酶活曲線 將培養(yǎng)4 d的毛殼菌接種到OL培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每隔1 d取樣，連續(xù)取12 d。

1.2.2 幾丁質(zhì)酶粗酶液的提取和純化 1) 粗酶液的提取。在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)到產(chǎn)酶量高峰期時，濾去菌絲，收集發(fā)酵液。用(NH4)2SO4沉淀蛋白，將蛋白離心后的沉淀以最小體積溶解于pH為6的磷酸緩沖液中，4 ℃下用相同的緩沖液透析。待粗酶液透析充分后與透析袋一起埋入PEG6000中，于4 ℃條件下進一步濃縮，得到體積大小為2 mL的粗酶液，備用。

2) 幾丁質(zhì)酶的純化。幾丁質(zhì)酶的純化參考王東輝等[7]的方法，并稍加改進?；钚噪娪就戤吅?，將分離膠從上至下依次切割成寬約2 mm的凝膠條，取每條凝膠的1/5研碎后加入底物檢測幾丁質(zhì)酶的活性，剩余部分用10 mmol/L的磷酸緩沖液(pH6.0)將蛋白浸泡析出。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶酶學性質(zhì)的測定 1)最適反應(yīng)溫度。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL純化的酶液，再加入200 μL膠體幾丁質(zhì)(1%)溶液，混合均勻，分別在20，30，40，50，60，70，80 ℃條件下保溫30 min，加入DNS試劑，沸水中煮沸10 min。以磷酸緩沖液加底物為對照，比色法測定不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的活性。

2)溫度穩(wěn)定性。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL純化的酶液，在20，30，40，50，60，70，80 ℃下保溫30 min，然后在每個Eppendorf管中加入200 μL膠體幾丁質(zhì)(1%)溶液，混合均勻，在最適反應(yīng)溫度下保溫30 min，加入DNS試劑，沸水中煮沸10 min，比色法測定幾丁質(zhì)酶的活性。

3)最適反應(yīng)pH。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL純化的酶液，再加入200 μL用pH分別為3，4，5，6，7，8，9的緩沖液配制的膠體幾丁質(zhì)(1%)溶液，混合均勻，在最適溫度下保溫30 min，加入DNS試劑，沸水中煮沸10 min，比色法測定幾丁質(zhì)酶的活性。

4) pH穩(wěn)定性。在1.5 mL的Eppendorf管中加入100 μL純化的酶液和400 μL pH分別為3，4，5，6，7，8，9的緩沖液，混合均勻，放置30 min。再加入200 μL膠體幾丁質(zhì)(1%)溶液，在最適溫度下保溫30 min，加入DNS試劑，沸水中煮沸10 min，比色法測定幾丁質(zhì)酶的活性。

5)金屬離子對酶活性的影響。先將含Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+和Mn2+的鹽用緩沖液配成溶液，各自所含的金屬離子濃度均為5 mmol/L。將底物膠體幾丁質(zhì)和純化的酶液加入到金屬離子溶液中，使其充分混勻，在最適溫度下保溫30 min，比色法測定幾丁質(zhì)酶的活性，以未加金屬離子的緩沖液為空白對照。

1.2.4 幾丁質(zhì)酶抑菌活性的測定 將培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上的立枯絲核菌和煙草赤星病菌，切成長度為2 mm大小的菌塊，投入到純化的幾丁質(zhì)酶液中，在28 ℃下浸泡8 h，取出后再接種到WA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察目標菌的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶的酶活曲線

用搖瓶發(fā)酵測定毛殼菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的酶活曲線，結(jié)果見圖1。圖1表明，接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的毛殼菌菌株生長迅速，培養(yǎng)第2天就開始形成大小均一的菌球，并開始分泌幾丁質(zhì)酶，在培養(yǎng)的第5天幾丁質(zhì)酶活力達到最高，之后幾丁質(zhì)酶活力平緩下降，到搖瓶培養(yǎng)12 d后仍可以檢測到酶活性的存在。

2.2 幾丁質(zhì)酶的分離純化

經(jīng)活性電泳方法純化得到具有幾丁質(zhì)酶活性的條帶，回收活性樣品成分，用SDS-PAGE電泳檢測，得到1條電泳純條帶，分子質(zhì)量約為43 ku(圖2)。收集的幾丁質(zhì)酶活性成分中無其他成分干擾，說明幾丁質(zhì)酶基本達到電泳純，而且回收率較高。

2.3 幾丁質(zhì)酶的酶學性質(zhì)

2.3.1 最適反應(yīng)溫度 由圖3可以看出，毛殼菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為40 ℃，低于或高于這個溫度幾丁質(zhì)酶反應(yīng)活性明顯降低，60 ℃時幾丁質(zhì)酶活性是40 ℃時的50%，到80 ℃時則完全檢測不到酶活性。說明該酶適合在比較溫和的溫度下發(fā)生反應(yīng)。

2.3.2 溫度穩(wěn)定性 由圖4可以看出，毛殼菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶在40 ℃以下保溫30 min均能保持其原來的活性，高于40 ℃以上保溫，其活性喪失速度較快，在70 ℃以上保溫30 min就完全喪失活性，說明該酶在較低的溫度(40 ℃以下)條件下可以保持穩(wěn)定性。

2.3.3 最適反應(yīng)pH 由圖5可以看出，毛殼菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的最適pH為6，在pH 4～8都有相對較高的活性，具有70%以上的相對活力。說明該幾丁質(zhì)酶在中性偏酸性的條件下具有較高的酶活性。

2.3.4 pH穩(wěn)定性 由圖6可以看出，毛殼菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶在pH 5～9的條件下保溫30 min仍舊具有較高的活性，相對酶活性可以達到80%以上。

2.3.5 金屬離子對幾丁質(zhì)酶活力的影響 由圖7可以看出，Ca2+和Zn2+能明顯增強幾丁質(zhì)酶的活性，Cu2+和Fe2+則對幾丁質(zhì)酶的活性有強烈抑制作用，其中Cu2+能抑制50%的酶活性，而Fe3+和Mn2+對幾丁質(zhì)酶的活性影響不大。

2.4 幾丁質(zhì)酶的抑菌活性

2.4.1 對立枯絲核菌的抑制作用 用純化的幾丁質(zhì)酶浸泡立枯絲核菌菌塊8 h，再接種到WA培養(yǎng)基上，24 h后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌塊邊緣無新的菌絲長出(圖8-A)，而在滅活的幾丁質(zhì)酶液處理的菌塊邊緣則有菌絲生長，且延伸較長，生長旺盛(圖8-B)，說明幾丁質(zhì)酶可以有效抑制立枯絲核菌菌絲的生長。

2.4.2 對煙草赤星病菌的抑制作用 由圖9可以看出，滅活酶液處理菌塊菌絲生長旺盛(圖9-A)，而幾丁質(zhì)純酶液處理煙草赤星病菌菌塊邊緣同樣無菌絲長出(圖9-B)，說明幾丁質(zhì)純酶液同樣完全抑制了煙草赤星病菌菌絲的生長。

3 討 論

生防真菌在侵染穿透寄主真菌細胞壁時能產(chǎn)生細胞壁降解酶(幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶等) ，在侵染過程中起著直接作用，其中以幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的作用更為重要[8-11]。Elad等[12]發(fā)現(xiàn),在哈茨木霉寄生齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)菌核的過程中，可在菌核內(nèi)部檢測到木霉分泌的幾丁質(zhì)酶及β-1，3-葡聚糖酶活性。林麗等[13]利用2種酵母菌防治桃采后的真菌病害，發(fā)現(xiàn)這2種酵母菌產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對軟腐病菌孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用。幾丁質(zhì)酶是生防真菌防治植物真菌性病原菌的主要機制之一，其能降解真菌的細胞壁，從而達到防治病害的目的[14]。

幾丁質(zhì)酶的純化方法很多，其中較為常用的有陰離子交換層析法、凝膠過濾層析法、免疫親和層析法等。也有研究者采用酶與底物結(jié)合然后洗滌的方法得到純酶[15]。本研究用改良過的活性電泳方法對幾丁質(zhì)酶進行純化，該方法在實驗室操作簡便，所需器材簡單，同時也能得到較好的純化效果。微生物幾丁質(zhì)酶的分子質(zhì)量差異很大, 一般為10～100 ku[16-17]。而真菌來源的幾丁質(zhì)酶的分子質(zhì)量大小比較接近，大部分在40～50 ku[16]。本試驗純化得到的幾丁質(zhì)酶的分子質(zhì)量在43 ku左右，與其他真菌來源的大部分幾丁質(zhì)酶的分子質(zhì)量比較接近。

Toyoda等[18]從灰霉素鏈霉菌(Streptomycesgriseus)菌株分離純化得到幾丁質(zhì)酶，可以消解正在發(fā)育的白粉病菌的吸器，并抑制白粉菌絲的伸長。本研究結(jié)果表明,純化幾丁質(zhì)酶能明顯抑制立枯絲核菌和煙草赤星病菌菌絲的伸長，使幾丁質(zhì)酶的抑菌作用得到較充分的證實。但有關(guān)幾丁質(zhì)酶與其他細胞壁降解酶(β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶等)的協(xié)同作用關(guān)系，以及其與病原菌的具體作用機制還有待于進一步研究。

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Enzymatic properties and antibacterial activity of chitinase fromChaetomiumsp.YMF1.00843

SUN Hui1，YANG Jin-kui2，ZHANG Ke-qin2

(1CollegeofAgronomy,ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering,Guangzhou,Guangdong510225,China;2LaboratoryforConservationandUtilizationofBio-Resources,YunnanUniversity,Kunming,Yunnan650091,China)

【Objective】 This research was conducted to study the enzymatic properties and antibacterial activity of chitinase fromChaetomiumsp.YMF1.00843,and lay foundation for further study of its inhibition mechanism.【Method】 Chitinase was purified by a one-step,native gel purification procedure before the properties were tested.Then,the antibacterial activity was confirmed by dipping pathogen bulk in enzyme solution.【Result】 Molecular weight of purified chitinase was 43 ku.Optimal temperature of chitinase was 40 ℃ and optimal pH was 6.0.Chitinase can maintain the initial activity at 40 ℃ or at pH of 5-9 for 30 min.The activity of chitinase was improved by Ca2+and Zn2+.The hyphae ofRhizoctoniasolaniandAlternariaalternatecan be effectively inhibited by purified chitinase. 【Conclusion】 Chitinase can maintain its activity at mild conditions and it can strongly inhibit the growth of several pathogens.

Chaetomiumsp.;chitinase;properties of enzyme;antibacterial activity

2013-11-11

國家自然科學基金項目(301600004)；云南省重點實驗室開放基金項目(KF-9803)

孫 輝(1978-)，女，黑龍江寶清人，講師，主要從事植物病害防治研究。E-mail：lemonsunh@163.com

時間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.009

S476.12

A

1671-9387(2015)05-0168-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.009.html