許 榮，張春林，寧 靜，李 建，雷安民

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2 第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032)

小鼠H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及表達(dá)

許 榮1,2，張春林1，寧 靜1，李 建1，雷安民1

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2 第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032)

【目的】 構(gòu)建小鼠pMX-H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,并使其在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)中異位表達(dá)，為進(jìn)一步研究H1foo在重編程方面的作用奠定理論基礎(chǔ)。【方法】 根據(jù)NCBI公布的小鼠H1foo基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，以小鼠卵巢組織總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增小鼠H1fooCDS序列，并連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX上。經(jīng)雙酶切鑒定和測序比對正確后，利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞plat-E的方法制備H1foo病毒液并感染MEF細(xì)胞,進(jìn)一步收集感染的細(xì)胞進(jìn)行半定量RT-PCR和免疫熒光染色檢測，分析其在細(xì)胞中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】 克隆得到915 bp的H1foo基因，構(gòu)建得到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-H1foo。該載體制備的病毒能夠感染MEF細(xì)胞，并且H1foo在MEF細(xì)胞中與細(xì)胞核共定位，而對照組綠色熒光蛋白(GFP)遍布整個(gè)細(xì)胞?！窘Y(jié)論】 成功構(gòu)建了pMX-H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并在MEF中進(jìn)行表達(dá)。

H1foo基因；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；多潛能性干細(xì)胞

卵母細(xì)胞特異性連接組蛋白 (oocyte-specific linker histone,H1foo)是組蛋白家族的成員之一，在哺乳動物卵母細(xì)胞和早期胚胎中特異性表達(dá)，對卵母細(xì)胞的發(fā)育、成熟、受精和早期胚胎的發(fā)育發(fā)揮著重要的作用。H1foo最早由Tanaka通過消減雜交的方法從小鼠中克隆得到，是卵中特異性表達(dá)的一種連接組蛋白，為單拷貝基因，定位于16號染色體上，開放閱讀框長912 bp，可編碼304個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為34 ku。與體細(xì)胞型的連接組蛋白有類似的結(jié)構(gòu)域，均由中間的球形域和兩端的C、N端結(jié)構(gòu)域組成，二者同源性低，但氨基酸和蛋白比對發(fā)現(xiàn)，H1foo與海膽卵母細(xì)胞表達(dá)的卵裂期組蛋白csH1[1]和爪蟾卵母細(xì)胞的連接組蛋白H1M(B4)[2]等非哺乳動物卵母細(xì)胞特異表達(dá)的連接組蛋白具有極高的同源性，均由N端、C端和中央的球狀域構(gòu)成，其中球狀域具有種屬及各連接組蛋白間的特異性[3-5]。

目前關(guān)于H1foo的研究很少，且大多數(shù)功能探索局限在成分復(fù)雜不明的卵母細(xì)胞中，這導(dǎo)致H1foo作用機(jī)制的研究工作面臨眾多可變因素，控制難度較大。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，H1foo具有抑制ES細(xì)胞分化，參與細(xì)胞重編程的作用[6]。H1foo能夠在體細(xì)胞的重編程中發(fā)揮作用，這就需要構(gòu)建特異性的H1foo表達(dá)載體來揭示其作用機(jī)理。而誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞技術(shù)是近年來受到廣泛關(guān)注的一種體細(xì)胞重編程技術(shù)，最早由Yamanaka利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX連接在4種轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)上，通過在體細(xì)胞中過表達(dá)這4種特定因子，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞到多能性細(xì)胞的重編程[7]。該技術(shù)使復(fù)雜的體內(nèi)細(xì)胞重編程能夠在體外實(shí)現(xiàn)，并受特定的4種因子的調(diào)控，這為研究特定因素對細(xì)胞重編程的影響機(jī)制提供了有力的支持。

小鼠是最主要的模式動物，本試驗(yàn)通過克隆小鼠的H1foo基因，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-H1foo，驗(yàn)證其在體細(xì)胞中的表達(dá)定位，以期為H1foo的功能機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

昆白小鼠和129品系小鼠購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMXs購自Addgene，大腸桿菌DH5α購自TIANGEN公司，Plat-E細(xì)胞系、pMX-GFP質(zhì)粒為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、氨芐青霉素購自TaKaRa，PCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，Trizol、瓊脂糖購自Invitrogen公司，DNA純化回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、DNA Marker均購自TIANGEN公司，胎牛血清、新生牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司，L-谷氨酰胺、非必需氨基酸購自Gibco公司，H1foo抗體購自Abcam公司，免疫熒光染色相關(guān)試劑購自碧云天公司，其他無特殊標(biāo)注的所有化學(xué)試劑均購自Sigma公司。引物合成及DNA測序均由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 鼠H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

1.3.1 鼠H1foo的克隆 根據(jù)GenBank中小鼠H1foo基因序列(GenBank登錄號NM_138311.2)及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX的酶切圖譜，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)H1foo特異性PCR擴(kuò)增引物H1fooa，其序列見表1。

注：H1fooa中Forward和Reverse序列中下劃線部分分別為BamHⅠ和SalⅠ的酶切位點(diǎn)。

Note:The underline letters highlight digestion sites ofBamHⅠ andSalⅠ.

取小鼠卵巢組織，用Trizol法提取其總RNA，依據(jù)Fermantas公司的Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，以H1fooa為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增H1foo的編碼區(qū)序列。PCR反應(yīng)體系為： 10×TaqBuffer with (NH4)2SO42.5 μL，25 mmol/L MgCl22.5 μL，上、下游引物各1 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，cDNA 4 μL，Taq酶0.25 μL，補(bǔ)水至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。將PCR獲得的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.2 鼠H1foo基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 將目的條帶按照DNA回收純化試劑盒說明書進(jìn)行純化后，進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物通過T4連接酶與經(jīng)同樣雙酶切的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX于16 ℃連接過夜，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-H1foo。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布在含有100 mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)陽性菌落，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜。菌液PCR鑒定正確后用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定，將鑒定正確的樣品送檢測序，測序鑒定正確后，進(jìn)行高純度質(zhì)粒的大量提取。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-H1foo的表達(dá)

1.4.1 小鼠MEF (胚胎成纖維細(xì)胞)的分離與培養(yǎng) 將昆白母鼠與129品系公鼠合籠后每天檢查陰道栓，待見栓13.5 d后，脫頸處死孕鼠，無菌操作取出胚胎，分離棄去胚胎的內(nèi)臟、四肢及頭部，期間清洗數(shù)次。剪碎組織，加入1.5 g/L胰蛋白酶(0.15 g胰蛋白酶溶于100 mL PBS中)消化后，繼續(xù)剪2 min，再加約3NmL(N為胚胎數(shù))的胰酶，置于培養(yǎng)箱于體積分?jǐn)?shù)5% CO2中37 ℃孵育15 min，期間每隔4 min取出培養(yǎng)皿用巴氏吸管吹打1 min。終止消化后離心，重懸細(xì)胞沉淀，接種于培養(yǎng)皿中，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃過夜培養(yǎng)，至細(xì)胞生長至90%融合并仍處于指數(shù)生長期時(shí)，凍存細(xì)胞。

1.4.2 H1foo轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞plat-E 轉(zhuǎn)染前一天在100 mm的培養(yǎng)皿中接種約4×106mL-1的plat-E細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d，在細(xì)胞生長至80%融合時(shí)換新鮮的培養(yǎng)液7.5 mL，1～2 h后利用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別將鼠pMX-H1foo和pMX-GFP陽性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到plat-E細(xì)胞中，制備逆轉(zhuǎn)錄病毒液，以GFP作為評價(jià)病毒感染效率的對照。轉(zhuǎn)染11～14 h后，小心換為新鮮培養(yǎng)液10 mL，在體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h。收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，0.45 μm濾器過濾病毒液，除去病毒液中的細(xì)胞碎片，并向plat-E培養(yǎng)皿中再加入10 mL新鮮培養(yǎng)基。

1.4.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MEF細(xì)胞 在六孔板中提前接種3孔MEF細(xì)胞，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，感染前更換新鮮培養(yǎng)液。向收集的H1foo和GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒液中分別加入polybrene，使其終質(zhì)量濃度為8 μg/mL。混勻，用該病毒液感染MEF細(xì)胞，感染過夜后換為含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清和10 g/L非必需氨基酸的高糖DMEM培養(yǎng)基，以GFP作為評價(jià)病毒感染效率的對照，MEF未感染組作陰性對照。第2天進(jìn)行病毒二次感染，步驟與第一次感染相同。

1.4.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的半定量PCR檢測 根據(jù)小鼠H1foo基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)H1foo特異性PCR半定量檢測引物H1foob，并以β-actin為內(nèi)參(2個(gè)引物的序列見表1)，檢測重組質(zhì)粒的表達(dá)能力。

將逆轉(zhuǎn)錄病毒液感染的MEF細(xì)胞與未感染處理的MEF細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用Trizol法提取總RNA，經(jīng)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄的體系和程序見Fermantas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 說明書。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，H1foob為引物，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為： 10×TaqBuffer with (NH4)2SO41.5 μL， 25 mmol/L MgCl21.6 μL，上、下游引物各0.3 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL，cDNA 1 μL，Taq酶 0.2 μL，補(bǔ)水至15 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。試驗(yàn)以β-actin為內(nèi)參基因，同時(shí)以pMX-H1foo質(zhì)粒為陽性對照。

1.4.5 免疫熒光檢測 分別處理逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MEF，檢測H1foo在蛋白水平的表達(dá)。用體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定逆轉(zhuǎn)錄病毒感染48 h后的MEF細(xì)胞，用PBS清洗3次，每次5 min；用體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100通透處理10 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入體積分?jǐn)?shù)1%的牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min；加入一抗H1foo(用封閉液稀釋,使其為體積比1∶400)4 ℃過夜孵育，PBS清洗3次；加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5 min；加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)處理2 min進(jìn)行細(xì)胞核染色，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 H1foo基因的PCR擴(kuò)增

以小鼠卵巢組織總RNA為模板，經(jīng)過RT-PCR擴(kuò)增得到915 bp的單一條帶(圖1)，與NCBI公布的小鼠H1fooCDS序列長度相符。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-H1foo的鑒定

圖2表明，重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-H1foo經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，獲得了5 200 bp左右的載體骨架和915 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)Blast比對，測序結(jié)果與NCBI公布的小鼠H1foo基因序列的相似性達(dá)100%。

圖1 鼠卵巢組織中H1foo的克隆
M1.DNA Marker DL5000；A.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX的BamHⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物；B,C.卵巢組織； M2.DNA Marker DL2000
Fig.1 Cloning ofH1foofrom mouse ovary
M1.DNA Marker DL5000;A.Enzyme digestion of retroviral vector;B,C.Ovary tissue;M2.DNA Marker DL2000

圖2 pMX-H1foo的酶切鑒定A～D.pMX-H1foo的BamHⅠ和SalⅠ雙酶切產(chǎn)物；
M1.DNA Marker DL5000；M2.DNA Marker DL2000
Fig.2 Enzyme digestion of pMX-H1foo A-D.Products of digestion byBamHⅠ andSalⅠ;
M1.DNA Marker DL5000；M2.DNA Marker DL2000

2.3 病毒液的制備

分別利用Plat-E細(xì)胞包裝pMX-H1foo和pMX-GFP病毒液，由于pMX-H1foo無熒光標(biāo)記，故以GFP作為評價(jià)病毒感染效率的對照。48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP感染組，以明場作為空白對照，由圖3可見，病毒液的轉(zhuǎn)染效率大約為99%。

圖3 Plat-E細(xì)胞感染pMX-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒48 h后感染效率的觀察(比例尺=100 μm)
A.感染GFP病毒液的MEF細(xì)胞；B.明場空白對照；C.A與B圖像的疊加
Fig.3 Production of pMX-GFP in Plat-E 48 h after infection (Bar=100 μm)
A.MEF cells infected with GFP virus;B.phase;C.Merge of A and B

2.4 感染細(xì)胞的半定量PCR檢測

病毒液感染MEF細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行半定量PCR檢測。結(jié)果顯示，從感染H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒的MEF中擴(kuò)增到731 bp的H1foo特異性檢測片段，而轉(zhuǎn)染GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒和未作處理的MEF中均未擴(kuò)增到相應(yīng)條帶(圖4)，表明本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pMX-H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

2.5 病毒感染MEF細(xì)胞的免疫熒光檢測

病毒感染MEF后進(jìn)行免疫熒光檢測，由圖5可知，感染H1foo病毒液的MEF經(jīng)H1foo抗體免疫熒光檢測顯示陽性的紅色熒光，感染GFP的MEF及未作病毒感染處理的MEF經(jīng)H1foo抗體檢測均為陰性。

3 討 論

核小體是組成染色體的基本結(jié)構(gòu)單元，其由4種核心組蛋白組成的八聚體(H2A,H2B,H3和H4各1對)與環(huán)繞周圍的DNA構(gòu)成。在相鄰的核小體之間，連接組蛋白H1以序列依賴性的方式綁定到DNA上，連接固定核小體，參與維持核小體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[8-10]。連接組蛋白家族是組蛋白中成員最多的家族，在真核生物中主要有11種不同的亞型，其中只有H1foo是卵特異性表達(dá)的連接組蛋白[11]，也是與H1組蛋白家族其他成員的序列同源性較低的一個(gè)特殊H1成員[4]。

H1foo基因?yàn)閱慰截惢?，定位于常染色體上， H1foo與其他非哺乳動物卵母細(xì)胞中特異表達(dá)的連接組蛋白，如海膽卵母細(xì)胞中的卵裂球組蛋白 (cleavage-stage histone1,csH1)和爪蟾卵母細(xì)胞中特異表達(dá)的組蛋白H1M(B4)有很高的同源性。檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠H1foo的mRNA在GV期卵母細(xì)胞到8細(xì)胞期胚胎均有表達(dá)，且隨著胚胎發(fā)育的推進(jìn)其表達(dá)量逐漸降低。蛋白水平上，GV期時(shí)H1foo的表達(dá)量最高，隨后逐漸降低，在4細(xì)胞期時(shí)已檢測不到H1foo的表達(dá)[11]。

圖4 病毒感染MEF細(xì)胞的半定量PCR檢測(β-actin為內(nèi)參)
M.DNA Marker Trans Plus 2000；A.感染H1foo病毒的MEF細(xì)胞； B.感染GFP病毒的MEF細(xì)胞； C.未作處理的MEF細(xì)胞；P.pMX-H1foo質(zhì)粒陽性對照；N.陰性對照
Fig.4 Semi-quantitative detection of infected MEF cells
(take β-actin as internal control)
M.Trans Plus 2000;A.MEF cell with H1foo virus;B.MEF cell with GFP virus;C.MEF;P.Positive;N.Negative control

圖5 感染逆轉(zhuǎn)錄病毒H1foo和GFP的MEF細(xì)胞的免疫熒光檢測
A.感染H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒的MEF細(xì)胞；B.未感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的MEF細(xì)胞；C.感染GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒的MEF細(xì)胞；1.GFP熒光觀察； 2.H1foo抗體檢測；3.DAPI驗(yàn)證細(xì)胞核； 4.圖片1，2，3的疊加；比例尺=100 μm
Fig.5 Immunofluorescence of MEF cells infected by H1foo or GFP
A.MEF cells infected with H1foo virus;B.Uninfected MEF cells;C.MEF cells with GFP virus;2.Anti-H1foo detection;3.DAPI;4.Merge of 1,2,3;Bar=100 μm

小鼠H1foo基因定位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，本研究將pMX-H1foo重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和pMX-GFP分別經(jīng)plat-E細(xì)胞包裝病毒，感染小鼠MEF細(xì)胞，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)H1foo與細(xì)胞核共定位，而GFP分散于整個(gè)細(xì)胞中，與之前的研究結(jié)果一致[3，12]。

H1foo參與體細(xì)胞的重編程過程。在小鼠、牛、豬等體外受精和核移植過程中均存在H1foo與其他成分的置換。在體外受精中發(fā)生的是卵中H1foo與精子內(nèi)魚精蛋白的置換[13-14]，核移植過程中則出現(xiàn)H1foo與體細(xì)胞型連接組蛋白的快速置換現(xiàn)象[15-17]，并且H1foo比被置換的成分具有更高的流動性，這種置換有利于供核體細(xì)胞染色質(zhì)構(gòu)象的打開，實(shí)現(xiàn)基因組的完全重編程，恢復(fù)全能性[13]。凝集的染色體被認(rèn)為是核重編程的一大障礙，不利于特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到緊密包裹起來的DNA位點(diǎn)上[18]。因此，高流動性的染色體結(jié)構(gòu)及染色體的解凝作用對提高重編程的效率有一定的作用。另有研究也發(fā)現(xiàn)，爪蟾屬GV期卵母細(xì)胞中的B4促進(jìn)了已分化體細(xì)胞的重編程[19]。ES細(xì)胞中異位表達(dá)H1foo后，會抑制細(xì)胞的分化，使細(xì)胞持續(xù)表達(dá)多潛能標(biāo)記基因Nanog、Myc和Klf9[6]，但其在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(iPSCs)中的作用仍未見報(bào)道。

誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞最早由Yamanaka等[7]利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX連接在4種轉(zhuǎn)錄因子上，通過在體細(xì)胞中過表達(dá)這4種因子，實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞到多能性細(xì)胞的重編程，但低效率及致癌性是其不容忽視的問題。然而，至今仍無相關(guān)研究指明是否是H1foo或其同源物B4在iPSCs細(xì)胞的產(chǎn)生過程中發(fā)揮著重要作用。目前，本實(shí)驗(yàn)小組已購買得到了商品化的Yamanaka 4因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)，并建立了穩(wěn)定的小鼠iPSCs誘導(dǎo)體系，本研究中所構(gòu)建的pMX-H1foo逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，為進(jìn)一步研究小鼠H1foo在誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞這一重編程過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and expression of retroviral vector pMX-H1foo in mouse embryonic fibroblast

XU Rong1,2,ZHANG Chun-lin1,NING Jing1,LI Jian1,LEI An-min1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2DepartmentofGeriatrics,XijingHospital,ForthMilitargMedicalUniversityXi’an,Shaanxi710032,China)

【Objection】 This study constructed and expressed recombinant retroviral plasmid pMX-H1foo in mouse embryonic fibroblast (MEF) cells to further investigate the function of H1foo in the induced pluripotent stem cell.【Method】 Primers ofH1foowere designed according to the published mRNA sequence of mouse oocyte-specific linker histone (H1foo:NM_138311.2) in NCBI database.The CDS ofH1foowas amplified from RNA of mouse ovary using RT-PCR and then cloned into the retroviral vector pMX.The recombinant retroviral plasmid was named as pMX-H1foo after being confirmed byBamHⅠ andSalⅠ double digestion and DNA sequencing.Then it was packaged in plat-E cells using the method of calcium phosphate transfection,and MEF was infected by the obtained virus after collecting viral supernatant.The expression of pMX-H1foo was identified by RT-PCR and immunofluorescence.【Result】 TheH1foogene was amplified and the recombinant retroviral plasmid pMX-H1foo was constructed successfully and infected into MEF cells.Semi-quantitative RT-PCR and immunofluorescence staining proved that H1foo was expressed in the nuclei of MEF cells while GFP was located everywhere in MEF cells.【Conclusion】 The construction and expression of recombinant retroviral plasmid pMX-H1foo in MEF cells was successful in this study.

H1foogene;retroviral vector;induced pluripotent stem cell

2013-12-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172280)

許 榮(1986-)，女，陜西西安人，在讀碩士，主要從事生物技術(shù)研究。E-mail:xurong1988416@nwsuaf.edu.cn

雷安民(1970-)，男，河南靈寶人，副教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事生物技術(shù)研究。 E-mail:anminleiryan@nwsuaf.edu.cn

時(shí)間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.020

Q78

A

1671-9387(2015)05-0021-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.020.html