徐厚英，周 博，李勝利，楊立軍，李創(chuàng)宏，李新平

(1西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家動物營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

催產(chǎn)素和苯甲酸雌二醇對小尾寒羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

徐厚英1，周 博1，李勝利2，楊立軍1，李創(chuàng)宏1，李新平1

(1西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家動物營養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

【目的】 研究催產(chǎn)素(OXT)和苯甲酸雌二醇(E2)對淋巴細(xì)胞增殖的影響，探討OXT和E2的相互作用機(jī)制。【方法】 分別以靜息和Con A刺激下的雌性綿羊外周血淋巴細(xì)胞為研究對象，用不同質(zhì)量濃度(低質(zhì)量濃度(OXT 10 ng/mL，E2 50 pg/mL)、中質(zhì)量濃度(OXT 100 ng/mL，E2 500 pg/mL)和高質(zhì)量濃度(OXT 1 000 ng/mL，E2 5 000 pg/mL))和處理方式(單用、聯(lián)用(二者同時加入、E2預(yù)處理12 h后加OXT、OXT預(yù)處理12 h后加E2))的OXT、E2處理細(xì)胞，用MTT試驗(yàn)檢測淋巴細(xì)胞的增殖水平，評估雌激素、催產(chǎn)素的相互作用方式?！窘Y(jié)果】 OXT對活化和靜息狀態(tài)的淋巴細(xì)胞均有抑制作用，且呈劑量依賴性。低質(zhì)量濃度的E2可促進(jìn)Con A刺激的T淋巴細(xì)胞增殖，但對靜息狀態(tài)的淋巴細(xì)胞無明顯影響；隨E2質(zhì)量濃度的增加，高質(zhì)量濃度的E2對不同狀態(tài)的淋巴細(xì)胞增殖均有抑制作用。低質(zhì)量濃度OXT和E2聯(lián)用條件下，Con A活化的T淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)值介于2種激素單獨(dú)作用之間；靜息狀態(tài)下的淋巴細(xì)胞增殖明顯受到抑制，該抑制作用均強(qiáng)于2種激素單獨(dú)作用；用生理濃度的OXT(10 ng/mL)和E2(50 pg/mL)對活化狀態(tài)的淋巴細(xì)胞分別進(jìn)行先后處理，對不同狀態(tài)淋巴細(xì)胞增殖的影響偏向于后加入的激素的作用?！窘Y(jié)論】 高質(zhì)量濃度的E2可抑制靜息和Con A刺激活化的淋巴細(xì)胞的增殖，低質(zhì)量濃度的E2對Con A刺激活化的淋巴細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，而OXT抑制淋巴細(xì)胞的增殖。高質(zhì)量濃度OXT和E2聯(lián)用，在靜息狀態(tài)的淋巴細(xì)胞上體現(xiàn)了協(xié)同作用；低質(zhì)量濃度OXT和E2聯(lián)用，在活化狀態(tài)的淋巴細(xì)胞上體現(xiàn)了相互頡頏和“利他作用”2種作用模式，顯示了二者相互作用方式的多樣性。

催產(chǎn)素；苯甲酸雌二醇；外周血淋巴細(xì)胞；MTT試驗(yàn)；小尾寒羊

雌激素是一種在女性性征形成和生殖過程中發(fā)揮至關(guān)重要作用的激素。雌激素在靶組織細(xì)胞中與雌激素受體結(jié)合(ER)，不僅影響乳房和子宮，而且影響大腦、骨骼、肝臟、心臟和其他組織。近年來的研究表明，雌激素對免疫系統(tǒng)也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在先天免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中，女性比男性更抗感染，對疫苗具有更強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，并且比男性有更多的移植排斥反應(yīng)[1]。樹突狀細(xì)胞(DC)、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等都表達(dá)雌激素受體，表明雌激素對這些細(xì)胞的功能具有調(diào)節(jié)作用[2]。催產(chǎn)素(OXT)是一種由下丘腦產(chǎn)生的九肽，通過神經(jīng)分泌囊泡運(yùn)輸?shù)侥X垂體后葉，經(jīng)特定刺激后儲存或釋放到血液循環(huán)中。OXT主要的內(nèi)分泌功能包括分娩過程中的子宮收縮和促使乳腺排乳[3]。大量證據(jù)表明，在動物模型中，催產(chǎn)素具有調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的作用。催產(chǎn)素能表現(xiàn)出抗炎作用，抵消敗血癥所致的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)增多，并防止多個器官受到損害[4]。

雌激素和催產(chǎn)素既然對免疫和炎癥反應(yīng)都能進(jìn)行調(diào)節(jié)，那么二者之間是否存在某種關(guān)系？本研究以小尾寒羊外周血淋巴細(xì)胞為研究對象，通過淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，探討雌激素和催產(chǎn)素對淋巴細(xì)胞增殖的影響，研究雌激素和催產(chǎn)素之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步闡明雌激素和催產(chǎn)素的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動物 發(fā)育正常且健康狀況良好的成年雌性小尾寒羊，由西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)管理并提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 催產(chǎn)素(OXT)和苯甲酸雌二醇(E2)注射液，購自哈爾濱三馬獸藥業(yè)有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)，購自美國Gibco公司；MTT、L-谷氨酰胺，由美國Sigma公司提供，其中MTT用pH 7.2的PBS緩沖液配成5 g/L的溶液備用；刀豆蛋白(Con A)、肝素鈉、人淋巴細(xì)胞分離液，購自北京索萊寶公司；DMSO，購自美國Amerco公司。酶標(biāo)儀BIO-RAD680，美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 綿羊外周血淋巴細(xì)胞的分離

無菌采集試驗(yàn)羊靜脈血20 mL，用密度梯度離心法[5]分離出外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為 3×106個/mL，PBS稀釋10倍，臺盼藍(lán)染色后觀察細(xì)胞活力。

1.3 OXT和E2對綿羊外周血淋巴細(xì)胞的影響

1.3.1 對靜息狀態(tài)淋巴細(xì)胞的影響 將上述靜息狀態(tài)下的淋巴細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國康寧)，每孔100 μL(3×105個/孔)，進(jìn)行OXT和E2處理。試驗(yàn)設(shè)空白對照組(1640培養(yǎng)液組)、細(xì)胞對照組(靜息狀態(tài)下的淋巴細(xì)胞組)、OXT組、E2組，加入刺激藥物后補(bǔ)足終體積至200 μL，每組5個復(fù)孔，所有處理均進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)。OXT的終濃度為10，100和1 000 ng/mL，E2的終濃度為50，500和5 000 pg/mL，分別為低質(zhì)量濃度、中質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度試驗(yàn)組。

1.3.2 對Con A 刺激活化的T淋巴細(xì)胞的影響 試驗(yàn)方法同1.3.1，只是細(xì)胞改為18 μg/mL Con A刺激的T淋巴細(xì)胞；細(xì)胞對照組為Con A刺激的T淋巴細(xì)胞；OXT的質(zhì)量濃度設(shè)10，100和1 000 ng/mL，E2的質(zhì)量濃度設(shè)5，50，500和5 000 pg/mL。

1.4 OXT和E2聯(lián)用對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

1.4.1 對靜息狀態(tài)淋巴細(xì)胞的影響 試驗(yàn)方法同1.3.1，試驗(yàn)設(shè)空白對照組(1640培養(yǎng)液組)、細(xì)胞對照組(靜息狀態(tài)下的淋巴細(xì)胞組)、OXT組、E2組、OXT與E2聯(lián)用組。根據(jù)1.3的試驗(yàn)結(jié)果，OXT的終濃度設(shè)1 000 ng/mL，E2的終濃度設(shè)5 000 pg/mL，均為高質(zhì)量濃度。OXT和E2聯(lián)用組又設(shè)時間因素，即二者共同加入(OXT+E2)、先加入OXT作用12 h后再加入E2(12 h OXT+E2)、先用E2處理12 h后再加入OXT(12 h E2+OXT)，觀察OXT與E2的相互作用。

1.4.2 對Con A 刺激活化的T淋巴細(xì)胞的影響 試驗(yàn)方法同1.4.1，只是細(xì)胞改為18 μg/mL Con A刺激的T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞對照組為Con A刺激的T淋巴細(xì)胞。OXT的終濃度為10 ng/mL，E2的終濃度為50 pg/mL。

1.5 MTT試驗(yàn)

經(jīng)過上述處理后，將供試細(xì)胞于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h，每孔中加入終濃度為5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，在490 nm波長下測定吸光度值，計算刺激指數(shù)(SI)：SI=(試驗(yàn)組細(xì)胞吸光值-空白對照組細(xì)胞吸光值)/(對照組細(xì)胞吸光值-空白對照組細(xì)胞吸光值) 。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 OXT和E2對綿羊外周血靜息淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖1結(jié)果表明，隨著質(zhì)量濃度的增加，OXT 和E2對綿羊靜息淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出劑量依賴性，低、中質(zhì)量濃度OXT和E2對靜息淋巴細(xì)胞增殖影響不顯著，但高質(zhì)量濃度OXT 和E2對淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用分別達(dá)極顯著和顯著水平。高質(zhì)量濃度OXT(1 000 ng/mL) 對綿羊靜息淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用顯著大于E2(5 000 pg/mL)，提示OXT對淋巴細(xì)胞的抑制作用較E2強(qiáng)。

2.2 OXT和E2對Con A刺激的綿羊外周血T淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖2結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的OXT對活化狀態(tài)的綿羊T淋巴細(xì)胞均有抑制作用，且隨著OXT質(zhì)量濃度的增高，其抑制作用逐漸增大，當(dāng)OXT質(zhì)量濃度為10～1 000 ng/mL時，與對照的差異分別達(dá)顯著和極顯著水平，并表現(xiàn)出劑量依賴性。E2對活化的綿羊T淋巴細(xì)胞增殖的影響隨其質(zhì)量濃度的變化而存在差異， 5 pg/mL E2對淋巴細(xì)胞增殖無影響， 50 pg/mL(E2處于生理濃度)E2對T淋巴細(xì)胞增殖有顯著的刺激作用，500 pg/mL E2對淋巴細(xì)胞增殖有輕微的抑制作用，而5 000 pg/mL E2則對淋巴細(xì)胞增殖表現(xiàn)出極顯著的抑制作用。

2.3 OXT和E2聯(lián)用對綿羊外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響

圖3-A表明，高質(zhì)量濃度OXT和E2(OXT 1 000 ng/mL，E2 5 000 pg/mL)聯(lián)用對靜息狀態(tài)下的淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且這種抑制作用較OXT和E2單獨(dú)使用時的抑制作用強(qiáng)，二者之間表現(xiàn)出協(xié)同作用。圖3-B表明，生理質(zhì)量濃度下(OXT 10 ng/mL，E2 50 pg/mL)，OXT和E2聯(lián)用對Con A活化的T淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出頡頏作用，OXT的抑制作用和E2的刺激作用均有所降低，相互抵消了各自的一部分作用；12 h OXT+E2對淋巴細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出刺激作用，與E2單獨(dú)作用時表現(xiàn)一致；12 h E2+OXT對淋巴細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出抑制作用，且與OXT單獨(dú)作用時一致。筆者推測，OXT和E2可能互相促進(jìn)了對方受體的表達(dá)，也即二者表現(xiàn)出“利他作用”。OXT和E2之間不同的作用方式與細(xì)胞狀態(tài)、激素的質(zhì)量濃度及激素的處理先后有關(guān)。由此推測，不同種類、質(zhì)量濃度和作用方式的激素對處于不同時間、空間狀態(tài)的細(xì)胞發(fā)揮作用時，可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果。

3 討 論

已知性激素除了對性分化和生殖發(fā)揮作用外，還可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[6]。有結(jié)果顯示，在免疫功能上女性比男性具有較高的免疫球蛋白水平和較強(qiáng)的免疫反應(yīng)[7]，同時女性對自身免疫性疾病也表現(xiàn)出較強(qiáng)的易感性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在靜息狀態(tài)下，低質(zhì)量濃度的E2對淋巴細(xì)胞增殖無影響，但隨著質(zhì)量濃度的增加，其對淋巴細(xì)胞的增殖顯示出抑制作用。Gilbody等[9]發(fā)現(xiàn)，雌二醇對大鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量有抑制作用，而且有劑量依賴性。Milica等[10]進(jìn)一步證實(shí)，切除大鼠卵巢可促進(jìn)外周血T淋巴細(xì)胞的增殖和機(jī)體的免疫反應(yīng)。在Con A刺激下，低質(zhì)量濃度的E2(50 pg/mL)在激活狀態(tài)下可顯著促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，這與Hofmann等[11]對貓外周血淋巴細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究結(jié)果一致。Gilbody等[9]的體外試驗(yàn)也證明，E2可提高Con A的刺激作用。高質(zhì)量濃度的E2對淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出抑制作用。Jenkins等[12]證明，17β-雌二醇可以劑量依賴的方式誘導(dǎo)Jurkat淋巴細(xì)胞的凋亡。Zajchowski等[13]的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高于生理濃度的E2可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡。E2具有免疫抑制及免疫刺激雙重作用，提示E2對淋巴細(xì)胞的作用不僅具有劑量依賴性，而且與細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)。這種雙向作用可能是E2與ERα/β通過和腳手架蛋白分子經(jīng)不同信號通路產(chǎn)生的[14]。對系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的研究發(fā)現(xiàn)，E2可以下調(diào) SLE患者活化T細(xì)胞內(nèi)凋亡分子FasL的表達(dá)，抑制PMA誘導(dǎo)的SLE患者T細(xì)胞的凋亡[15]。因此E2可能通過對淋巴細(xì)胞的調(diào)控參與自身免疫疾病，但具體機(jī)制尚不明確。由此可以推測，E2可能并不是女性對自身免疫性疾病易感的罪魁禍?zhǔn)?，即E2不會引起女性自身免疫性疾病的發(fā)生，而可能是在機(jī)體免疫功能激惹時，其可促進(jìn)免疫功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。

OXT和E2均對女性的母性行為發(fā)揮著重要的作用，借助于淋巴細(xì)胞能否發(fā)現(xiàn)E2和OXT之間相互作用的新方式，這很讓人期待。低質(zhì)量濃度的E2和OXT同時加入活化狀態(tài)的T淋巴細(xì)胞中，E2和OXT發(fā)揮了各自的作用，T淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)(SI)值介于E2和OXT單獨(dú)作用時的SI之間，提示E2和OXT之間存在相互頡頏作用，這與傳統(tǒng)的觀點(diǎn)[19]不太一致；而靜息狀態(tài)下，二者同時加入表現(xiàn)出相互協(xié)同的作用，對淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用較2種激素各自單獨(dú)使用時強(qiáng)。E2預(yù)處理Con A活化的T淋巴細(xì)胞12 h后，再加入OXT，T淋巴細(xì)胞的增殖受到抑制，抑制程度與單獨(dú)使用OXT的處理結(jié)果相似；OXT預(yù)處理Con A活化的T淋巴細(xì)胞12 h后，再加入E2刺激淋巴細(xì)胞增殖，刺激作用與E2單獨(dú)作用的結(jié)果一致。筆者對雄性綿羊外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行了同樣處理，得到的結(jié)果與雌性綿羊一致，說明E2和OXT在不同性別機(jī)體內(nèi)的作用方式可能一致。Insel等[20]也觀察到了這樣的結(jié)果。筆者推測，OXT和E2可能互相促進(jìn)了對方受體的表達(dá)，這種現(xiàn)象體現(xiàn)了二者的“利他行為”[21]。這種行為不僅人、鼠存在，在其他動物中也存在，如在綿羊[22]上也發(fā)現(xiàn)了這種行為。Mccarthy等[23]證實(shí)，預(yù)處理E2能夠提高OXT的抗焦慮作用，而且還能夠加強(qiáng)OXT的母性行為，同時OXT也能促進(jìn)E2的親昵行為。

利他行為是一種社會行為，OXT能夠調(diào)節(jié)這種行為[22]，因此其是一種極為重要的社會激素[24]。OXT通過神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用[25]，與OXT受體有關(guān)[26]。已有報道指出，E2可顯著增加牛T淋巴細(xì)胞OXT受體 mRNA 的表達(dá)[27]。而E2對社會行為的影響可通過增加OXT的表達(dá)來產(chǎn)生[28]，也有可能是提高了OXT與其受體的結(jié)合。對新生草原田鼠的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后早期OXT可顯著增加下丘腦雌激素受體α(ERα)mRNA的表達(dá)[29]；Yamamoto等[30]的研究也發(fā)現(xiàn)，OXT可促進(jìn)新生兒發(fā)育階段ERα mRNA的表達(dá)。

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Effects of oxytocin and estradiol benzoate on proliferation of peripheral blood lymphocytes of Small-tail Han sheepinvitro

XU Hou-ying1,ZHOU Bo1,LI Sheng-li2,YANG Li-jun1,LI Chuang-hong1,LI Xin-ping1

(1CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)

s： 【Objective】 This study investigated the effects of oxytocin (OXT) and estradiol (E2) on proliferation of peripheral blood lymphocytes and explored the interaction between OXT and E2.【Method】 The peripheral blood lymphocytes of female sheep at rest and stimulated by Concanavalin A (Con A) were treated by different concentrations of OXT and E2 (low concentrations of OXT 10 ng/mL and E2 50 pg/mL,medium concentrations of OXT 100 ng/mL and E2 500 pg/mL,and high concentrations of OXT 1 000 ng/mL and E2 5 000 pg/mL) and by different treatment methods (single use and combined use: simultaneous addition,E2 was 12 h after OXT,and OXT was 12 h after E2) before MTT assay was used to test the proliferation of lymphocytes and interaction of OXT and E2 was evaluated.【Result】 OXT had suppressive effect on both active and rested lymphocyte at low dose.E2 at low concentrations could promote the proliferation of T lymphocytes stimulated with Con A but had no effects on lymphocytes at rest.As the increase of concentration,E2 had suppressive effect on lymphocytes at different statuses.Thus,for the combination of OXT and E2 at low concentrations,the stimulation index (SI) of T lymphocytes stimulated with Con A was between the SI values of OXT or E2 alone.The lymphocytes at rest were significantly suppressed and the suppressive effect was stronger than OXT or E2 alone.Active lymphocytes treated with OXT and E2 at normal concentrations in succession had similar effects on proliferation of lymphocytes to adding hormone later.【Conclusion】 E2 at high concentration inhibited the proliferation of lymphocytes,whereas it promoted active lymphocytes at low concentration.OXT inhibited proliferation of lymphocytes.OXT and E2 at high concentration had synergy effect on lymphocytes at rest.OXT and E2 at low concentration had antagonism and altruistic effects on lymphocytes stimulated by Con A.

oxytocin;estradiol benzoate;peripheral blood lymphocyte;MTT assay;Small-tail Han sheep

2013-12-08

西北農(nóng)林科技大學(xué)人才引進(jìn)基金項(xiàng)目

徐厚英(1985-)，女，山東日照人，在讀碩士，主要從事營養(yǎng)及生長生理研究。E-mail:vicky880306@163.com

李新平(1967-)，男，湖北谷城人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事動物營養(yǎng)及生長生理、獸藥新劑型的研究。 E-mail: lxp67cqu@163.com

時間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.021

S859.79+3;S857.2+1

A

1671-9387(2015)05-0027-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.021.html