黃 偲，蘭道亮，林寶山，陳亞冰，王樹(shù)茂，李 鍵,

(西南民族大學(xué) a 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

牦牛Cygb基因的克隆及序列分析

黃 偲a，蘭道亮b，林寶山a，陳亞冰a，王樹(shù)茂a，李 鍵a,b

(西南民族大學(xué) a 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，b 青藏高原研究院，四川 成都 610041)

【目的】 對(duì)牦牛Cygb基因進(jìn)行克隆與序列分析，為進(jìn)一步深入研究Cygb基因在牦牛對(duì)低氧環(huán)境適應(yīng)性中的作用提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā?參照GenBank中牛的Cygb基因序列設(shè)計(jì)引物，提取牦牛肝組織RNA，以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版，克隆牦牛Cygb基因并進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對(duì)所得序列進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】 牦牛Cygb基因編碼區(qū)全長(zhǎng)573 bp，編碼190個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物分子質(zhì)量21.5 ku，理論等電點(diǎn)為6.61。蛋白預(yù)測(cè)表明，Cygb編碼蛋白整體表現(xiàn)為親水性，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋及延伸鏈構(gòu)成。同源性分析表明，11條序列當(dāng)中牦牛與牛、綿羊等物種具有較高的同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中距離最近，其中牦牛與牛的同源性最高，達(dá)到99.0%。【結(jié)論】 克隆到573 bp的牦牛Cygb基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，該序列在哺乳動(dòng)物中具有很高的保守性。

牦牛；Cygb基因；克隆；序列分析

細(xì)胞珠蛋白(Cytoglobin，Cygb)是在脊椎動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的5 種攜氧球蛋白之一，與血紅蛋白(Haemoglobin，Hb)、肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)和腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb) 共同組成“珠蛋白超家族(Globin superfamily)”，球蛋白X(Globin X，GbX)作為第五類型的脊椎動(dòng)物的球蛋白，只存在于魚(yú)類和兩棲類動(dòng)物中[1]。Cygb幾乎存在于脊椎動(dòng)物的所有體細(xì)胞內(nèi)[2-3]，具有與經(jīng)典珠蛋白Hb和Mb不同的“六配位”血紅素-鐵配位形式，使之具備在缺氧或器官纖維化時(shí)表達(dá)升高的特性[4]。Cygb主要分布于結(jié)締組織成纖維細(xì)胞、肝星形細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中， 定位于胞質(zhì)，亦分布于神經(jīng)系統(tǒng)的某些特殊神經(jīng)細(xì)胞亞群及視網(wǎng)膜的某些特殊類型細(xì)胞內(nèi)，且定位于胞質(zhì)和胞核中[5]。

經(jīng)典珠蛋白Hb和Mb的結(jié)構(gòu)、功能與進(jìn)化等已研究得相當(dāng)深入，而Cygb和Ngb的相關(guān)研究主要集中在臨床醫(yī)學(xué)方面，對(duì)于環(huán)境適應(yīng)性方面作用的研究仍處于初級(jí)階段。目前的研究認(rèn)為，Cygb除具有與珠蛋白超家族成員都有的運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧氣、維持細(xì)胞氧化代謝的功能外，還具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶活性以及NO清道夫和參與膠原合成等功能，且其表達(dá)在缺氧或器官纖維化時(shí)表現(xiàn)出升高特性[6-8]。進(jìn)一步研究顯示，該特性與低缺氧適應(yīng)性和膠原代謝有關(guān)，可能為動(dòng)物機(jī)體低氧適應(yīng)性研究及相關(guān)疾病的診斷治療提供了新思路。Cygb在腦部特定區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都有分布，能夠受腦缺氧的誘導(dǎo)。體內(nèi)、體外試驗(yàn)均表明，其在缺氧情況下表達(dá)上調(diào)，能增加腦組織對(duì)缺氧的耐受能力，抵抗氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的損傷[9]。細(xì)胞珠蛋白對(duì)肝星狀細(xì)胞氧化損傷也具有顯著性保護(hù)作用[10]。此外，有關(guān)試驗(yàn)證實(shí)，大鼠皮膚切創(chuàng)后，創(chuàng)周皮膚Cygb基因的 mRNA表達(dá)隨損傷時(shí)間而呈規(guī)律性變化，其時(shí)序性變化規(guī)律可望作為皮膚損傷經(jīng)歷時(shí)間推斷的客觀指標(biāo)[11]。目前，關(guān)于Cygb的研究主要集中在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而對(duì)于其在環(huán)境適應(yīng)性上的研究尚比較少。

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高原環(huán)境下的特有物種，其機(jī)體早已適應(yīng)高海拔低缺氧環(huán)境，目前尚未見(jiàn)到牦牛Cygb基因的相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)通過(guò)RT-PCR技術(shù)首次克隆并得到牦牛Cygb基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，對(duì)獲得的目的基因進(jìn)行了序列分析，旨在為進(jìn)一步探明Cygb在牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑

本試驗(yàn)所用的安多牦牛肝臟組織，采自甘肅甘南藏族自治州夏河縣。

本試驗(yàn)所用普通PCR儀、電泳儀、瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，LATaqDNA聚合酶、大腸埃希菌DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，pMD19-T克隆載體購(gòu)自TaKaRa(大連)有限公司，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen(北京)公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的牛(Bostaurus)cytoglobin基因Cygb序列(GenBank登錄號(hào)為：NM_001206720.1)，用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如表1。引物由上海Invitrogen公司合成。

1.2.2 牦牛肝臟組織RNA的提取和cDNA的合成 取牦牛肝臟組織100 mg，置于研缽中，迅速加入1 mL Trizol，后加入液氮進(jìn)行研磨提取總RNA。采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL：oligo dT181 μL，5×Reaction Buffer 4 μL，RibolockTMRnase Inhibitor (20 U/μL) 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μL) 1 μL，模板1 μL，最后用RNase Free dH2O補(bǔ)足20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?2 ℃ 60 min；70 ℃ 5 min。合成cDNA并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 牦牛Cygb基因的克隆和測(cè)序 以牦牛肝臟組織cDNA為模板，引物為Cygb-F和Cygb-R。反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，2×TaqMasteMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水10 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，Axygen凝膠回收試劑盒回收純化目的產(chǎn)物。

將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，連接反應(yīng)體系為：pMD18-T Vector 0.5 μL，Ligate Mix 5 μL，膠回收DNA 4.5 μL，用滅菌水補(bǔ)足至10 μL，16 ℃反應(yīng)16 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并在青霉素(Amp)瓊脂平板上涂板，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑選單菌落，重懸于10 μL滅菌水中，以次菌液為模板，反應(yīng)程序和條件同上，進(jìn)行菌液PCR鑒定，確定陽(yáng)性克隆菌液，從中篩選3個(gè)接種于20 mL的LB液體培養(yǎng)基中(Amp，100 μg/mL)，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h，取菌液800 μL于1.5 mL滅菌離心管，送往Invitrogen(上海)公司測(cè)序。

1.2.4 牦牛Cygb基因的序列分析 利用Expasy在線軟件對(duì)其基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析；利用DNAStar軟件對(duì)基因編碼產(chǎn)物親/疏水性、柔韌性/抗原性進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用在線軟件PBIL LYON-GERLAND對(duì)Cygb基因編碼的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用DNAStar軟件子程序MegAlign的Clustal W方法與GenBank中公布的部分物種Cygb基因序列進(jìn)行同源性比較；利用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛Cygb基因的擴(kuò)增

牦牛Cygb基因擴(kuò)增結(jié)果(圖1)顯示，擴(kuò)增片段大小為573 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。

2.2 牦牛Cygb基因的基本理化性質(zhì)

擴(kuò)增得到牦牛Cygb基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為573 bp(GenBank登錄號(hào)為：KF425757)，利用Expasy等生物信息學(xué)在線軟件對(duì)其基本理化性質(zhì)的分析結(jié)果顯示，Cygb基因開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)573 bp，編碼190個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物分子質(zhì)量為21.5 ku，理論等電點(diǎn)為6.61。氨基酸組成中，正電荷殘基為24個(gè)，負(fù)電荷殘基為25個(gè)，整個(gè)蛋白帶負(fù)電荷。

2.3 牦牛Cygb基因編碼產(chǎn)物親/疏水性、柔韌性/抗原性預(yù)測(cè)

用DNAStar軟件子程序Prostean對(duì)Cygb基因編碼產(chǎn)物的親/疏水性、柔韌性/抗原性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，Cygb基因編碼產(chǎn)物的親水性殘基所占比例大于疏水性殘基，因此推測(cè)其編碼蛋白整體表現(xiàn)為親水性[12]。

2.4 牦牛Cygb基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用在線軟件PBIL LYON-GERLAND預(yù)測(cè)組成Cygb多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的3種類型，表明α螺旋、延伸鏈和自由卷曲的比例為48.42∶34.74∶16.84，說(shuō)明該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋及延伸鏈2種結(jié)構(gòu)元件組成，自由卷曲相對(duì)較少，β螺旋則散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.5 牦牛與其他物種Cygb基因的同源性

利用DNAStar軟件子程序MegAlign的Clustal W方法，與GenBank中公布的部分物種Cygb基因序列的同源性和差異性進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示。

注：1.牦牛;2.黑猩猩;3.家犬;4.家鼠;5.斑馬魚(yú);6.獼猴;7.綿羊;8.牛;9.人;10.原雞;11.爪蟾。對(duì)角線上為同源性數(shù)據(jù)，下為差異性數(shù)據(jù)。

Note:1.Yak;2.Pantroqlodytes;3.Canislupusfamiliaris;4.Musmusculus;5.Daniorerio;6.Macacamulatta;7.Ovisaries;8.Bostaurus;9.Homosapiens;10.Gallusgallus;11.Xenopuslaevis.Homologous data is above the diagonal and below is divergent data.

表2表明，牦牛Cygb基因序列與其他10個(gè)物種相比，同源性最高的是牛，高達(dá)99.0%；最低的是斑馬魚(yú)，為57.4%；與家犬、人、獼猴、綿羊、黑猩猩、家鼠的同源性都高于90%；與原雞、爪蟾的同源性分別為76.7%和67.7%。差異性分析結(jié)果表明，牦牛Cygb基因序列與黃牛差異性最小，僅為1.1%，與其他哺乳動(dòng)物的差異性也低于10%。上述結(jié)果說(shuō)明，Cygb基因在哺乳動(dòng)物間具有較高的保守性。

2.6 牦牛Cygb基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

用MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法，重復(fù)1 000次，用獲得的11個(gè)Cygb基因核苷酸序列構(gòu)建Bootstrap驗(yàn)證的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，牦牛與牛Cygb基因的親緣關(guān)系最近，并與綿羊、人、黑猩猩、家犬、家鼠形成哺乳動(dòng)物的一個(gè)分支，原雞代表的鳥(niǎo)類和爪蟾代表的兩棲動(dòng)物形成一個(gè)與牦牛遺傳距離較遠(yuǎn)的分支，而斑馬魚(yú)代表的魚(yú)類與牦牛的遺傳距離最遠(yuǎn)。

3 討 論

本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)所得序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示牦牛Cygb的mRNA序列與牛的同源性為99%，且1%的堿基不同并未導(dǎo)致氨基酸序列的改變，同時(shí)與其他哺乳動(dòng)物的同源性也達(dá)到90%以上，這說(shuō)明在牦牛近緣物種，甚至整個(gè)哺乳動(dòng)物中Cygb都具有較高的保守性。由此推測(cè)，該基因應(yīng)當(dāng)具有非常重要的生理功能，其表達(dá)的蛋白質(zhì)對(duì)于不同物種都有重要意義[13]。此外，牦牛與牛、綿羊等生長(zhǎng)于具有顯著海拔差異地區(qū)的不同物種在Cygb基因上表現(xiàn)出的高同源性也表明，如果該基因的表達(dá)確實(shí)引起了牦牛對(duì)于低氧環(huán)境的良好適應(yīng)性，那么決定因素應(yīng)存在于編碼區(qū)外。Fordel等[11]的研究證實(shí)：Cygb的上游區(qū)段含有一個(gè)啟動(dòng)子，包含有缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor，HIF-1)和能與HIF-1特異性結(jié)合位點(diǎn)起作用的缺氧反應(yīng)原件(Hypoxia-responsive elements，HRES)。在缺氧條件下，Cygb受缺氧誘導(dǎo)，表達(dá)明顯上調(diào)[14-15]。本研究對(duì)牦牛Cygb基因進(jìn)行了克隆和序列分析，為進(jìn)一步深入研究Cygb基因在牦牛對(duì)低氧環(huán)境適應(yīng)中的作用奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)試驗(yàn)可以對(duì)不同氧分壓下生活的同種牦牛各主要器官的Cygb表達(dá)量進(jìn)行定量分析，并與不同海拔近緣動(dòng)物進(jìn)行對(duì)比，以確定Cygb基因的表達(dá)是否存在明顯差異性，從而有望進(jìn)一步揭示Cygb基因?qū)?dòng)物低氧環(huán)境適應(yīng)性的意義。

[1] Anja R,Christine F,Thomas H,et al.A globin gene of ancient evolutionary origin in lower vertebrates:Evidence for two distinct globin families in animals [J].Mol Biol Evol,2005,22(1):12-20.

[2] Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et al.A vertebrate glob in expressed in the brain [J].Nature,2000,407(6803):520-523.

[3] Burmester T,Ebner B,Weich B,et al.Cytoglobin:A novel globin type ubiquitously expressed in vertebrate tissues [J].Mol Biol Evol,2002,19(4):416-421.

[4] 秦豪杰，陳寶生.大鼠皮膚切創(chuàng)愈合過(guò)程中Cygb及HIF-1αmRNA的表達(dá) [J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2013,28(1):8-10.

Qin H J,Chen B S.Expressions ofcytoglobinandHIF-1αmRNA during skin incised wound healing in rats [J].Chinese Journal of Forensic Medicine,2013,28(1):8-10.(in Chinese)

[5] 杜顯剛,官 鵬,陳雪梅,等.腦紅蛋白在大鼠體內(nèi)的分布 [J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2005,20(5):260-262.

Du X G,Guan P,Chen X M,et al.An immunohistochemical study on the distribution of neuroglobin in rat tissues [J].Chinese Journal of Forensic Medicine,2005,20(5):260-262.(in Chinese)

[6] 賈曉健,張玉彬.胞紅蛋白的結(jié)構(gòu)功能與藥理學(xué)活性研究進(jìn)展 [J].藥物生物技術(shù),2010,17(3):268-272.

Jia X J,Zhang Y B.Recent advances in structure, function and pharmacological activity of cytoglobin [J].Pharmaceutical Biotechnology,2010,17(3):268-272.(in Chinese)

[7] Xu R,Harrison P,Chen M,et al.Cytoglobin over expression protects against damage-induced fibrosis [J].Molecular Therapy,2006,13:1093.

[8] Shaw R J,Omar M M,Rokadiya S,et al.Cytoglobin is up-regulated by promoter hypoxia and silenced by promoter hy-permethylation in head and neck cancer [J].Br J Cancer,2009,101(1):139.

[9] 田樹(shù)鳳，楊漢華.細(xì)胞紅蛋白在缺氧性腦損傷中的研究進(jìn)展 [J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,13(13):2578-2580.

Tian S F,Yang H H.Research progression of cytoglobin during hypoxia brain injury [J].Progress in Modern Biomedicine,2013,13(13):2578-2580.(in Chinese)

[10] 張 瀟,史雪川.細(xì)胞紅蛋白表達(dá)及調(diào)控的研究 [J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2011,10(3):220-222.

Zhang X,Shi X C.Research development of cytoglobin’s expression and regulation [J].Journal of Clinical and Experimental Medicine,2011,10(3):220-222.(in Chinese)

[11] Fordel E,Geuens E,Dewilde S,et al.Hypoxia/ischemia and the regulation of neuroglobin and cytoglobin expression [J].IUBMB Life,2004,56(11212):681-687.

[12] 原金錢,路義鑫,韓彩霞,等.本地毛形線蟲(chóng)HSP70基因的克隆與序列分析 [J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2007,37(12):1062-1065.

Yuan J Q,Lu Y X,Han C X,et al.Cloning and sequence analysis ofHSP70 gene from trichinella native [J].Veterinary Science in China,2007,37(12):1062-1065.(in Chinese)

[13] Ostojic J,Grozdanic S D,Syed N A,et al.Trent JT 3rd patterns of distribution of oxygen-binding globins,neuroglobin and cytoglobin in human retina [J].Arch Ophthalmia,2008,126(11):1530-1536.

[14] Shivapurkar N,Stastny V,Okumura N,et al.Cytoglobin,the newest member of the globin family,functions as a tumor suppressor gene [J].Cancer Res,2008,68(18):7448-7456.

[15] Guo X,Philipsen S,Tan-UnK C.Study of thehypoxia-dependeregulation of humanCYGBgene [J].Biochemical Biophysical Research Cammunications,2007,364(1):145-150.

Cloning and sequence analysis of cytoglobin gene in Yak

HUANG Caia,LAN Dao-liangb,LIN Bao-shana,CHEN Ya-binga,WANG Shu-maoa,LI Jiana,b

(aCollegeofLifeScienceandTechnology,bCollegeofTibetanPlateauResearch,SouthwestUniversityforNationalities,Chengdu,Sichuan610041,China)

【Objective】 This study cloned and analysed sequence of yak cytoglobin gene to improve the further study ofCygbgene.【Method】 Based on the cygb gene sequence of bovine in GenBank,primers were designed to cloneCygbgene from yak.RNA from yak liver was extracted and cDNA synthesized by reverse transcription reaction was used as cloning template.Then theCygegene was cloned and sequenced.【Result】 The length of the clonedCygbcDNA was 573 bp with a peptide of 190 amino acids,the molecular weight of 21.5 ku and pI of 6.61.Protein prediction showed that Cygb protein was hydrophilic and the secondary structure of its protein were mainly alpha helix and extended strand.Sequence homology analysis shows that yak had higher homology withBostaurus,Ovisariesand other mammals among the 11 sequences.The gene sequence of yak andBostaurushad the highest homology of 99.0%.【Conclusion】 TheCygbcDNA (573 bp) was cloned and its sequence was very conservative in mammals.

yak;Cygbgene;cloning;sequence analysis

2013-12-13

西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(CX2014SZ97)

黃 偲(1989-)，男，湖南株洲人，在讀碩士，主要從事高原動(dòng)物生理學(xué)研究。E-mail:376960915@qq.com

李 鍵(1967-)，男，四川理縣人，教授，博士，主要從事動(dòng)物生殖調(diào)控研究。E-mail:lijian@swun.cn

時(shí)間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.014

S823.8+52

A

1671-9387(2015)05-0007-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.014.html