張永剛,王 偉,張艷敏,董學(xué)前*

(山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,山東 濟(jì)南 250013)

齊整小核菌SCL2010產(chǎn)小核菌多糖培養(yǎng)基優(yōu)化的研究

張永剛,王 偉,張艷敏,董學(xué)前*

(山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院,山東 濟(jì)南 250013)

采用單因素和正交試驗(yàn)對小核菌多糖高產(chǎn)菌株齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了深入地篩選與優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖45.0 g/L,玉米漿1.5 g/L,NaNO32.0 g/L,K2HPO4·3H2O 2.0 g/L,檸檬酸0.7 g/L,MgSO4·7H2O 1.5 g/L,KCl 2.0 g/L。在此優(yōu)化條件下,小核菌多糖的產(chǎn)量為31.81 g/L,碳源轉(zhuǎn)化率為70.69%。采用發(fā)酵罐進(jìn)行小試放大試驗(yàn),小核菌多糖的產(chǎn)量達(dá)到31.86 g/L,碳源轉(zhuǎn)化率為70.80%,發(fā)酵液表觀黏度達(dá)到4 500 mPa·s,并將發(fā)酵時(shí)間縮短至60 h左右,具有顯著效果。

小核菌多糖;齊整小核菌;高產(chǎn)菌株;培養(yǎng)基;優(yōu)化

小核菌多糖(scleroglucan)又稱硬葡聚糖,小核菌膠是由絲狀真菌齊整小核菌產(chǎn)生的非離子水溶性多糖,其分子是由含有β-D-(1,6)-葡萄糖殘基側(cè)鏈的線性β-D-(1,3)-葡萄糖殘基鏈組成。小核菌多糖的顯著特性是良好的流變性與穩(wěn)定性,在廣泛的pH(1～12)、礦化度(0～200 000 g/L)和溫度(130℃)均具有良好的穩(wěn)定性[1-3]。小核菌多糖在石油工業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在當(dāng)前油田普遍進(jìn)入三次、四次采用的趨勢下,小核菌多糖在用于提高原油采收率的助劑方面具有廣闊的市場前景[4-8]。但是,目前限制小核菌多糖應(yīng)用的最主要因素是因?yàn)楫a(chǎn)量不高使其價(jià)格居高不下,這嚴(yán)重限制了其市場的開發(fā)拓展。因此,研究提高小核菌多糖的產(chǎn)率是相關(guān)研究的主要關(guān)注點(diǎn)。截止目前,已有通過高產(chǎn)菌株篩選誘變、培養(yǎng)基與發(fā)酵條件優(yōu)化、發(fā)酵罐設(shè)計(jì)等提高小核菌多糖產(chǎn)量的相關(guān)研究[4,9-12]。

目前關(guān)于小核菌多糖發(fā)酵生產(chǎn)的相關(guān)研究所采用的菌株主要有齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)ATCC 201126、ATCC 15205、MTCC 2156[12-14],發(fā)酵培養(yǎng)基成分基本相同,發(fā)酵碳源為蔗糖,有機(jī)氮源為酵母膏發(fā)酵產(chǎn)率多在20 g/L左右[15-17]。為提高小核菌多糖的發(fā)酵產(chǎn)率,篩選得一株顯著高產(chǎn)小核菌多糖的絲狀真菌,通過18SrDNA測序比對,該菌株屬于齊整小核菌,命名為齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010。經(jīng)初步發(fā)酵研究表明齊整小核菌SCL2010合成小核菌多糖的發(fā)酵過程與現(xiàn)有報(bào)道具有顯著區(qū)別。在已有研究報(bào)道中,發(fā)酵液的pH變化基本一致,由4.5逐漸下降至2.0左右,而菌株SCL2010發(fā)酵過程中pH由初始的4.5迅速下降至2.8左右后緩慢回升至3.8,其高產(chǎn)特性可能與其獨(dú)特的pH變化有關(guān)。本研究采用齊整小核菌SCL2010作為生產(chǎn)菌株,通過對發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化提出了適合于高產(chǎn)菌株齊整小核菌SCL2010發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的培養(yǎng)基組成及其比例,為后續(xù)工業(yè)化制備奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010:已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(China center for type culture collection,CCTCC),保藏編號:NO.M2014325。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、NaNO3、K2HPO4·3H2O、檸檬酸、MgSO4·7H2O、KCl、蔗糖、果糖等(均為分析純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、玉米漿:西王集團(tuán)有限公司;酵母膏、蛋白胨(均為生化試劑):安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖50.0 g/L,酵母膏2.0 g/L,NaNO32.0 g/L,K2HPO4·3H2O 1.0 g/L,檸檬酸0.7 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,KCl 0.5 g/L,pH 4.5,115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CF16RN臺式高速離心機(jī):日本日立公司;ZQWY-200振蕩培養(yǎng)箱:上海知楚儀器有限公司;10 L自動生物反應(yīng)器:上海百侖生物科技有限公司;FM200高剪切均質(zhì)機(jī):上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;DV2T型黏度計(jì):美國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 小核菌多糖搖瓶及發(fā)酵罐培養(yǎng)條件[4,11,16]

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件:搖瓶裝液量80 mL/500 mL,接種量10%,發(fā)酵溫度28℃,搖床轉(zhuǎn)速300 r/min,發(fā)酵時(shí)間72 h。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件:裝液量60%,接種量10%,發(fā)酵溫度28℃,攪拌轉(zhuǎn)速350 r/min,發(fā)酵時(shí)間72 h。

1.3.2 小核菌多糖產(chǎn)量和生物量[16]

取10 mL發(fā)酵液中和后用蒸餾水稀釋3～4倍,80℃水浴30 min,均質(zhì)1～2 min后8 000×g離心30 min。上清液加兩倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沉淀小核菌多糖,過濾后再用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇洗滌一次后所得沉淀在85℃條件下干燥,稱質(zhì)量測定小核菌多糖產(chǎn)量。離心所得沉淀用蒸餾水溶解洗滌后8 000×g離心30 min,所得沉淀在80℃條件下干燥至恒質(zhì)量,稱質(zhì)量即為生物量。

1.3.3 分析測定

發(fā)酵液表觀黏度采用DV2T型黏度計(jì)測定:64號轉(zhuǎn)子,60 r/min、25℃。

1.0 %多糖溶液黏度采用DV2T型黏度計(jì)測定:63號轉(zhuǎn)子,60 r/min、25℃。

采用斐林試劑法測定發(fā)酵液中的殘?zhí)橇縖18]。

1.3.4 小核菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化單因素試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)采用搖瓶發(fā)酵條件,以小核菌多糖產(chǎn)量作為主要考察指標(biāo),根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)要求選擇增加其他輔助考察指標(biāo)如生物量、1%多糖溶液黏度、殘?zhí)?、碳源轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵液表觀黏度等,考察不同的碳源(玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、果糖)、葡萄糖添加量(35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L、60 g/L、65 g/L)、有機(jī)氮源(酵母膏、玉米漿、蛋白胨、大豆蛋白胨、水解豆粉)、玉米漿添加量(0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L)、無機(jī)鹽添加量(NaNO3、K2HPO4、MgSO4、KCl)對小核菌多糖發(fā)酵的影響。

1.3.5 小核菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以多糖產(chǎn)量作為考察指標(biāo),以葡萄糖、玉米漿、K2HPO4和MgSO4添加量作為影響因素,采用4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)基配方的進(jìn)一步優(yōu)化,正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 小核菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium formula optimization of scleroglucan fermentation

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

選擇玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、果糖等作為碳源,添加量均為30 g/L,發(fā)酵時(shí)間為72 h,考察不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on scleroglucan production

由圖1可知,以玉米淀粉、馬鈴薯淀粉和葡萄糖作為碳源時(shí),小核菌多糖的產(chǎn)量相對較高,蔗糖和木薯淀粉次之,其他碳源則不利于多糖的合成;蔗糖與葡萄糖作為碳源時(shí),1.0%小核菌多糖溶液的黏度較高;玉米淀粉、馬鈴薯淀粉和木薯淀粉作為碳源時(shí),菌體生物量較高。綜合考慮小核菌多糖的產(chǎn)量與產(chǎn)品品質(zhì),選擇葡萄糖作為菌株SCL2010發(fā)酵生產(chǎn)小核菌多糖的碳源。

2.2 葡萄糖添加量對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

圖2 不同的葡萄糖添加量對產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.2 Effects of different glucose addition on scleroglucan production

由圖2可知,隨著葡萄糖添加量的增加,小核菌多糖產(chǎn)量呈上升趨勢;當(dāng)葡萄糖添加量為45 g/L時(shí),小核菌多糖產(chǎn)量達(dá)到29.80 g/L,生物量為15.04 g/L,碳源轉(zhuǎn)化率達(dá)到66.2%;但當(dāng)葡萄糖添加量＞45 g/L后,多糖產(chǎn)量增加放緩,碳源轉(zhuǎn)化率開始顯著下降,殘?zhí)橇考眲∩仙?。因?該菌株發(fā)酵生產(chǎn)小核菌多糖適宜葡萄糖添加量為45 g/L。

2.3 有機(jī)氮源對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

圖3 不同有機(jī)氮源對產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.3 Effects of different organic nitrogen sources on scleroglucan production

由圖3可知,當(dāng)以玉米漿為有機(jī)氮源時(shí),小核菌多糖產(chǎn)量和菌體生物量分別達(dá)到28.51 g/L和10.72 g/L,都高于其他4種有機(jī)氮源,因此菌株SCL2010適合的有機(jī)氮源為玉米漿。氮源的種類對1.0%多糖產(chǎn)品的黏度影響不大。綜合考慮小核菌多糖的產(chǎn)量與產(chǎn)品品質(zhì),選擇玉米漿作為菌株SCL2010發(fā)酵生產(chǎn)小核菌多糖的有機(jī)氮源。

2.4 玉米漿添加量對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

由圖4可知,隨著玉米漿添加量的增加,菌體生物量呈上升趨勢;當(dāng)玉米漿添加量為1.5 g/L時(shí),多糖產(chǎn)量最大,為28.23 g/L;小核菌多糖產(chǎn)量在玉米漿添加量＞2.0 g/L時(shí)變化不大,小核菌多糖的合成量開始下降。因此,玉米漿適宜添加量為1.5 g/L。

圖4 不同玉米漿添加量對產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.4 Effects of different corn steep liquor addition on scleroglucan production

2.5 無機(jī)鹽對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

圖5 無機(jī)鹽對小核菌多糖產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of inorganic salt on scleroglucan production

由圖5可知,K2HPO4和MgSO4在一定范圍內(nèi)對小核菌多糖的產(chǎn)量影響顯著,因此選擇作為后續(xù)正交試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基組分;其他兩種無機(jī)鹽NaNO3和KCl則分別選擇2.0 g/L、2.0g/L作為優(yōu)化后培養(yǎng)基中的添加量。

2.6 培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,對影響較顯著的葡萄糖添加量(A)、玉米漿添加量(B)、K2HPO4添加量(C)、和MgSO4添加量(D)進(jìn)行了4因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化,結(jié)果與分析見表2、方差分析見表3。

由表2可知,各因素對小核菌多糖產(chǎn)量影響由大到小依次為A＞B＞D＞C,即葡萄糖＞玉米漿＞MgSO4＞K2HPO4。由極差分析得出正交試驗(yàn)優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為A3B2C3D1,即葡萄糖50.0 g/L;玉米漿1.5 g/L;K2HPO42.0 g/L和MgSO41.5g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),多糖產(chǎn)量為32.15 g/L,碳源轉(zhuǎn)化率達(dá)到64.30%。在正交試驗(yàn)中最優(yōu)配方組合A2B2C3D1,即葡萄糖45.0 g/L;玉米漿1.5 g/L;K2HPO42.0g/L和MgSO41.5g/L條件下,小核菌多糖的產(chǎn)量為31.81g/L;碳源轉(zhuǎn)化率為70.69%。在以多糖產(chǎn)量為主要參考指標(biāo)綜合考慮碳源轉(zhuǎn)化率后,選擇小核菌多糖的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為A2B2C3D1,即葡萄糖45.0 g/L;玉米漿1.5 g/L;K2HPO42.0 g/L和MgSO41.5 g/L。

表2 小核菌多糖培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization of scleroglucan fermentation

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知,葡萄糖和玉米漿添加量對小核菌多糖產(chǎn)量的影響顯著(P＜0.05),其他因素對小核菌多糖產(chǎn)量影響不顯著(P＞0.05)。

2.7 發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

圖6 小核菌多糖發(fā)酵罐發(fā)酵曲線Fig.6 Fermentation curve of scleroglucan in fermentor

以小核菌多糖高產(chǎn)菌株齊整小核菌SCL2010為生產(chǎn)菌株,采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基在10 L自動發(fā)酵罐進(jìn)行放大試驗(yàn),其發(fā)酵過程如圖6所示。由圖6可知,小核菌多糖的產(chǎn)量達(dá)到31.86 g/L,碳源轉(zhuǎn)化率為70.80%,與搖瓶驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果基本符合;發(fā)酵液表觀黏度達(dá)到4 500 mPa·s,顯著高于現(xiàn)有研究報(bào)道[9-17];多糖產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)在發(fā)酵60 h左右比搖瓶發(fā)酵速度快。

3 結(jié)論

對小核菌多糖高產(chǎn)菌株齊整小核菌SCL2010的培養(yǎng)基成分進(jìn)行了篩選與優(yōu)化,通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化,獲得了小核菌多糖的高產(chǎn)優(yōu)化培養(yǎng)基,其組成為葡萄糖45.0g/L;玉米漿1.5g/L;NaNO32.0g/L;K2HPO4·3H2O2.0g/L;檸檬酸0.7 g/L;MgSO4·7H2O 1.5 g/L;KCl 2.0 g/L。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方條件下,小核菌多糖的產(chǎn)量為31.81 g/L;碳源轉(zhuǎn)化率為70.69%,達(dá)到了小核菌多糖的高產(chǎn)目的。最后采用10 L發(fā)酵罐進(jìn)行小試放大試驗(yàn),小核菌多糖的產(chǎn)量達(dá)到31.86 g/L,碳源轉(zhuǎn)化率為70.80%,發(fā)酵液表觀黏度達(dá)到4 500 mPa·s,顯著高于現(xiàn)有研究報(bào)道[9-17],并將發(fā)酵時(shí)間縮短至60 h左右。研究結(jié)果對于小核菌多糖的工業(yè)化生產(chǎn)具有顯著促進(jìn)作用。

[1]FARI?A J I,SI?ERIZ F,MOLINA O E,et al.Isolation and physicochemical characterization of soluble scleroglucan fromSclerotium rolfsii.Rheological properties,molecular weight and conformational characteristics[J].Carbohyd Polym,2001,44(1)：41-50.

[2]FARI?A J I,VI?ARTA S C,CATTANEO M,et al.Structural stability of Sclerotium rolfsiiATCC 201126 β-glucan with fermentation time：a chemical,infrared spectroscopic and enzymatic approach[J].J Appl Microbiol,2009,106(1)：221-232.

[3]VI?ARTA S C,DELGADO O D,FIGUEROA L I C,et al.Effects of thermal,alkaline and ultrasonic treatments on scleroglucan stability and flow behavior[J].Carbohyd Polym,2013,94(1)：496-504.

[4]SCHMID J,MEYER V,SIEBER V.Scleroglucan：biosynthesis,production and application of a versatile hydrocolloid[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,91(4)：937-947.

[5]天津市工業(yè)微生物研究所.小核菌硬葡聚糖發(fā)酵液作為油田鉆井液處理劑的應(yīng)用,CN201210587334.4[P].2013-05-08.

[6]李 冰,張建法,蔣鵬舉.真菌硬葡聚糖的生產(chǎn)及在油田上的應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2003,30(5):99-102.

[7]杜冠樂,段 凡.天然高分子在油田鉆井液的應(yīng)用研究[J].石油化工應(yīng)用,2013,32(8):1-4.

[8]HALLIBURTON ENERGY SERVICES,INC.Inhibiting salting out of diutan or scleroglucan in well treatment：US,20140378353 A1[P].2014-12-25.

[9]天津市工業(yè)微生物研究所.小核菌硬葡聚糖在線發(fā)酵提取方法及系統(tǒng),CN201110006769.0[P].2013-06-05.

[10]TASKINM,ERDALS,CANLIO.Utilizationofwasteloquat(Eriobotrya JaponicaLindley)kernels as substrate for scleroglucan production by locally isolatedSclerotium rolfsii[J].Food Sci Biotechnol,2010,19(4)：1069-1075.

[11]SURVASE S A,SAUDAGAR P S,SINGHAL R S.Production of scleroglucan fromSclerotium rolfsiiMTCC 2156[J].Bioresour Technol,2006,97(8)：989-993.

[12]WANG Y,MCNEIL B.Scleroglucan and oxalic acid formation bySclerotium glucanicumin sucrose supplemented fermentations[J].Biotechnol Lett,1994,16(6)：605-610.

[13]FARI?A J I,SANTOS V E,PEROTTI N I,et al.Influence of the nitrogen source on the production and rheological properties of scleroglucan produced bySclerotium rolfsiiATCC 201126[J].World J Microbiol Biotechnol,1999,15(2)：309-316.

[14]SCHILLING B M,RAU U,MAIER T,et al.Modeling and scale-up of the unsterile scleroglucan production process withSclerotium rolfsii ATCC 15205[J].Bioprocess Eng,1999,20(3)：195-201.

[15]SURVASESA,SAUDAGARPS,SINGHALRS.Useofcomplexmedia for the production of scleroglucan bySclerotium rolfsiiMTCC 2156[J].Bioresource Technol,2007,98(7)：1509-1512.

[16]FARI?A J I,SI?ERIZ F,MOLINA O E,et al.High scleroglucan production bySclerotium rolfsii：influence of medium composition[J].Biotechnol Lett,1998,20(9)：825-831.

[17]SCHILLINGBM.Sclerotium rolfsiiATCC 15205 in continuous culture：Economical aspects of scleroglucan production[J].Bioprocess Eng,2000,22(1)：57-61.

[18]楊林娥,彭曉光,楊慶文,等.斐林試劑法測定還原糖方法的改進(jìn)[J].中國釀造,2010,29(5):160-161.

ZHANG Yonggang,WANG Wei,ZHANG Yanmin,DONG Xueqian*
(Shandong Food Ferment Industry Research&Design Institute,Jinan 250013,China)

Q93-335

0254-5071(2017)11-0049-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.11.011

2017-09-01

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GGX102015)

張永剛(1985-),男,工程師,碩士,研究方向?yàn)槲⑸锞酆衔锇l(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

*通訊作者:董學(xué)前(1978-),男,研究員,碩士,研究方向?yàn)槲⑸锞酆衔锛百Y源化利用。