楊 文，沈 文，郭海英，陳冬梅，陳凱麗，孫延鳴

(石河子大學(xué) a 動物科技學(xué)院，b 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

新疆巴什拜羊BPI基因cDNA全長的克隆及序列分析

楊 文a，沈 文a，郭海英a，陳冬梅a，陳凱麗b，孫延鳴a

(石河子大學(xué) a 動物科技學(xué)院，b 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

【目的】 克隆巴什拜羊殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(BPI)的cDNA序列，為研究該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?采集巴什拜羊外周血液，從中分離得到中性粒細(xì)胞后提取RNA。根據(jù)GenBank中牛BPI基因的cDNA 序列設(shè)計(jì)兼并引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增巴什拜羊BPI基因部分序列，再根據(jù)已知的巴什拜羊BPI基因部分序列設(shè)計(jì)RACE引物，分別擴(kuò)增出5′和3′端目的片段，分別回收克隆的目的基因片段，再與pMD18-T載體連接，分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆，將重組菌測序后進(jìn)行拼接，獲得巴什拜羊BPI基因全長 cDNA 序列，并對序列進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】 克隆的巴什拜羊BPI基因cDNA序列全長1 922 bp，其中開放閱讀框?yàn)? 452 bp，共編碼483個氨基酸；BLAST分析表明，巴什拜羊BPI基因的核苷酸序列與綿羊、牛、虎鯨、野豬、獼猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾核苷酸的一致性分別為99%，91%，78%，74%，64%，61%，58%，53%和50%；氨基酸進(jìn)化分析顯示，巴什拜羊首先與綿羊聚為一類，其次與牛聚為一類，該聚類分析結(jié)果與生物學(xué)分類結(jié)果表現(xiàn)一致?！窘Y(jié)論】 通過RACE方法成功地克隆了1 922 bp的巴什拜羊BPI基因cDNA全長序列，且基因進(jìn)化樹聚類結(jié)果與生物學(xué)分類結(jié)果相一致。

巴什拜羊；BPI基因；殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白；cDNA 末端快速擴(kuò)增

殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白(Bactericidal permeability increasing protein, BPI)是存在于機(jī)體中性粒細(xì)胞內(nèi)的一種陽離子抗菌肽，是中性粒細(xì)胞內(nèi)多種抗菌成分中惟一能夠直接對革蘭氏陰性菌發(fā)揮毒性作用, 且對游離的脂多糖(LPS) 具有中和作用的物質(zhì)[1]。BPI最早發(fā)現(xiàn)于1978年，Weiss等[2]利用離子交換和凝膠過濾層析法從人的中性粒細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒中分離純化而得到天然BPI蛋白質(zhì)，因其能通過增強(qiáng)革蘭氏陰性菌外膜的通透性，逐漸使其失活而得名。已有報(bào)道證實(shí)，BPI具有殺菌、中和內(nèi)毒素、促進(jìn)補(bǔ)體活化、調(diào)理吞噬功能、抑制血管生成、抑制炎性介質(zhì)釋放、抗原蟲、抗真菌等作用，對革蘭氏陰性菌肺炎和急性肺損傷也有顯著的保護(hù)作用[3-9]。

巴什拜羊?qū)儆谂？凭d羊?qū)?，是新疆地方?yōu)良品種，具有早熟性好、生長發(fā)育快、耐寒、耐粗飼、體質(zhì)結(jié)實(shí)、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。目前對BPI的研究主要集中在人、鼠和豬上，國內(nèi)外尚未見有關(guān)羊BPI的研究報(bào)道。因此，本研究以新疆巴什拜羊?yàn)檠芯繉ο?，對其BPI基因全長cDNA序列進(jìn)行克隆及序列分析，以期為進(jìn)一步研究巴什拜羊BPI基因的分子結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 5只巴什拜羊，均購自塔城裕民縣巴什拜羊繁育基地。

1.1.2 菌種及主要試劑 大腸桿菌DH5α由石河子大學(xué)生化實(shí)驗(yàn)室提供，酶焦磷酸二乙酯(DEPC)購于Sigma公司，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (批號：PR14596) 購自Clontech公司，3′-Full RACE Core Set試劑(批號：6106)盒購自寶生物工程有限公司，TRIzol(批號：15596-026)購自Invitrogen公司，中性粒細(xì)胞分離液(批號：20110218)購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，DNA凝膠回收試劑盒(批號：1101G06)、質(zhì)粒提取試劑盒(批號：1011G23)購自上海捷瑞生物工程有限公司，pMD 18-T Vector載體(批號：CK5201AA)購自寶生物工程有限公司，DNA MakerⅠ、dNTP、TaqDNA酶均購自北京天根生化科技有限公司，試驗(yàn)用Hank’s液、PBS溶液參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南配制[12]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank中牛的BPI基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物B1和B2，其中B1的序列為：5′-GGCAAYTTTGACCTGAG-3′；B2的序列為：5′-TTCAGTTCCAGGAGCAG-3′。

根據(jù)擴(kuò)增序列以及SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 和TaKaRa3′-Full RACE Core Set Ver.2.0的要求，利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)RACE引物。其中3′RACE特異性引物GSP1的序列為:5′-GCGGCTCTGAGTCTGGGCTAT-3，巢式PCR引物NGSP1的序列為:5′-TGACCCTGACT-CGGGCCACTCCACT-3′；5′RACE特異性引物GSP2的序列為: 5′-CAGAAAGGTTCAAGTTCATCTCAAGC-3′，巢式PCR引物NGSP2的序列為:5′-GTTCAAGTTCATCTCAAGCAGGA-3′。

以上引物均由華大基因合成。

1.2.2 中性粒細(xì)胞的分離及其RNA的提取 頸靜脈采集巴什拜羊血液，按照中性粒細(xì)胞分離液說明書中的方法分離外周血中性粒細(xì)胞。用TRIzol法抽提巴什拜羊中性粒細(xì)胞總RNA。提取的總RNA用無菌DEPC水溶解，用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用分光分度計(jì)測定OD260和OD280，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA第一鏈的合成 以巴什拜羊中性粒細(xì)胞提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

(1)3′-RACE cDNA第一鏈的合成。反應(yīng)體系為RNA樣品1 μL，3′RACE Adaptor 1 μL，5×M-MLV Buffer 2 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)0.25 μL，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)(200 U/μL)0.25 μL，RNase Free dH2O 4.5 μL。反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。

(2)5′-RACE cDNA第一鏈的合成。反應(yīng)體系為RNA樣品3 μL，5′-CDS引物1 μL，SMART Ⅱ A寡聚核苷酸接頭1 μL，加RNase Free dH2O至5 μL，混勻，瞬時離心，70 ℃水浴加熱2 min，立即放入冰水浴中冷卻2 min，稍離心，將溶液收集到管底。在反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2 μL、DTT(20 mmol/L) 1 μL、dNTP(10 mmol/L) 1 μL、PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，混勻，瞬時離心后于42 ℃溫浴保溫90 min，加20 μL用Trinine-EDTA緩沖液稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，作為RT-PCR反應(yīng)的模板。

1.2.4BPI基因cDNA序列3′末端的擴(kuò)增 按照3′-Full RACE Core Set試劑盒說明，以新疆巴什拜羊中性粒細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)得到的3′-RACE cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，1×cDNA Dilution Buffer Ⅱ 8 μL，GSP1(10 μmol/L)2 μL，3′-RACE Outer Primer(10 μmol/L)2 μL，10×LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+Free)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，TaKaRa LATaq(5 U/μL)0.25 μL，dH2O 28.75 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.5BPI基因cDNA序列5′末端的擴(kuò)增 按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書，以新疆巴什拜羊中性粒細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)得到的5′-RACE cDNA第一鏈為模板，以試劑盒附帶的UPM引物和GSP2引物進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為：5′-RACE-Ready 2.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 1 μL，TaqPolymerase(2.5 U)1 μL，10×UPM 5 μL，GSP2 1 μL,dH2O 34.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，20個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.6 3′末端cDNA和5′末端cDNA PCR產(chǎn)物的克隆 將3′末端和5′末端PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定正確后，按照DNA膠回收試劑盒說明書分別切膠回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定后，陽性克隆菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.7 序列分析 用DNAMAN軟件對所得序列進(jìn)行拼接測序，并應(yīng)用該軟件預(yù)測其RNA的二級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用DNAstar對克隆所得的巴什拜羊BPI基因與其他物種BPI的核苷酸序列進(jìn)行一致性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴什拜羊中性粒細(xì)胞及RNA的檢測

頸靜脈采集巴什拜羊血液，抗凝血經(jīng)中性粒細(xì)胞分離液分離后，試管中液體分為4層，其中第3層為中性粒細(xì)胞。用槍頭吸出中性粒細(xì)胞后，用TRIzol法抽提中性粒細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測所提取的總RNA質(zhì)量，計(jì)算OD260/OD280=1.9，證明所提總RNA的質(zhì)量較好，無降解和蛋白質(zhì)污染；用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的RNA，可明顯看見2條清晰的條帶，分別是28S、18S (圖1)，28S和18S的濃度比約為2∶1，說明所提取的RNA完整性較好。

2.2 BPI基因cDNA 3′末端的擴(kuò)增

圖2顯示，BPI基因的3′-RACE擴(kuò)增出724 bp的條帶。將其克隆到pMD18-T載體后，經(jīng)PCR鑒定正確。

2.3 BPI基因cDNA 5′末端的擴(kuò)增

圖3顯示，BPI基因5′-RACE擴(kuò)增出1 487 bp的條帶。將其克隆到pMD18-T載體后，經(jīng)PCR鑒定正確。

2.4 BPI基因cDNA 序列分析

通過DNAMAN軟件將3′-RACE和5′-RACE序列進(jìn)行拼接后，得到巴什拜羊BPI基因1 922 bp 的全長cDNA序列(GenBank登錄號:KF523344)，其核苷酸序列及編碼蛋白的氨基酸序列見圖4。

圖4 巴什拜羊BPI基因核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列
Fig.4 Nucleotide sequences and the deduced amino acid sequence of Baishibai sheepBPIgene

巴什拜羊BPI基因全長cDNA序列的開放閱讀框?yàn)? 452 bp；起始密碼子為ATG，位于54～56 bp；終止密碼子為TGA，位于1 506～1 508 bp；共編碼483個氨基酸，編碼區(qū)兩側(cè)翼分別具有 5′-UTR 54 bp(1～54 bp)和 3′-UTR 416 bp(1 507～1 922 bp)，在 poly(A)尾前32 位(1 795～1 800 bp)出現(xiàn)加尾信號ATTAAA。

ProtParam程序顯示，BPI基因cDNA序列開放閱讀框內(nèi)堿基的使用情況為：A有330個，占22.73%；G有356個，占24.52%；T有327個，占22.52%；C有439個，占30.23%。

2.5 BPI基因RNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

應(yīng)用DNAMAN軟件預(yù)測BPI基因的RNA二級結(jié)構(gòu)，圖5表明，其RNA二級結(jié)構(gòu)由數(shù)個三葉草型莖環(huán)結(jié)構(gòu)交聯(lián)組合而成。

將巴什拜羊BPI基因測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)果顯示，巴什拜羊BPI基因核苷酸序列與綿羊、牛、虎鯨、野豬、獼猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾的一致性分別為99%，91%，78%，74%，64%，61%，58%，53%和50%。將克隆得到的巴什拜羊BPI基因的氨基酸序列用DNAstar

軟件分別與上述9種動物BPI基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果(表1)表明，巴什拜羊與綿羊、牛BPI基因氨基酸序列的一致性在91%以上，與虎鯨、野豬的一致性在70%以上。由BPI基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖6)可知，巴什拜羊首先與綿羊聚為一類，其次跟牛聚為一類，與實(shí)際生物學(xué)分類情況相符。

圖5 巴什拜羊BPI基因RNA的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
Fig.5 Secondary structure prediction of Baishibai sheepBPIRNA

3 討 論

本研究利用RACE方法克隆了新疆巴什拜羊的BPIcDNA基因序列，其全長為1 922 bp，其中開放閱讀框(ORF)為1 452 bp，共編碼 483個氨基酸，隨后對其基因序列和RNA的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。本研究進(jìn)行時GenBank尚未見有關(guān)羊的BPI基因序列登錄，故本試驗(yàn)只好根據(jù)牛BPI基因序列設(shè)計(jì)簡并引物，根據(jù)已知的BPI部分序列設(shè)計(jì)RACE引物，利用RACE技術(shù)分別擴(kuò)增出BPI5′端和3′端序列，最后經(jīng)測序后拼接而成完整的巴什拜羊BPI全長cDNA序列，結(jié)果表明用此方法克隆未知基因序列是可行的。

在本試驗(yàn)即將完成時，GenBank上發(fā)布了綿羊BPImRNA的預(yù)測序列(GenBank登錄號:XP_004014614)，該序列是通過GNOMON程序?qū)d羊13號染色體基因組序列(GenBank登錄號:NW_004080176.1)進(jìn)行分析預(yù)測得到的BPImRNA基因序列。預(yù)測的綿羊BPI基因mRNA序列全長 為1 827 bp，開放閱讀框1 452 bp。本試驗(yàn)結(jié)果表明，巴什拜羊與已登錄的綿羊BPI基因編碼序列有5處核苷酸差異，相似性為99.66%，有3處氨基酸差異，相似性為99.38%。進(jìn)一步分析差異基因，表明巴什拜羊編碼序列第327位處于密碼子第3位的T變?yōu)镃，第369位處于密碼子第3位的C變?yōu)門，這2處核苷酸的改變并未導(dǎo)致氨基酸的變化，巴什拜羊編碼序列第964位處于密碼子第1位的A變?yōu)镚，即編碼第322位氨基酸的密碼子由ACC變?yōu)镚CC，從而導(dǎo)致了氨基酸由蘇氨酸 (Thr)轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?(Ala)；第1 132位處于密碼子第1位的T變?yōu)镃，即編碼第378位氨基酸的密碼子由TCC變?yōu)镃CC，導(dǎo)致氨基酸由絲氨酸 (Ser)轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?(Pro)；第1 258位處于密碼子第1位的G變?yōu)锳，即編碼第420位氨基酸的密碼子由GTC變?yōu)锳TC，導(dǎo)致氨基酸由纈氨酸 (Val)轉(zhuǎn)變?yōu)楫惲涟彼?(Ile)。氨基酸的這些改變，是否會導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)的改變以及功能的不同，尚有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)在運(yùn)用RACE技術(shù)擴(kuò)增巴什拜羊BPI基因cDNA 5′ 末端時，始終擴(kuò)增不出目的片段。查閱文獻(xiàn)得知，mRNA某些區(qū)段形成的二級結(jié)構(gòu)會阻礙反轉(zhuǎn)錄的正常進(jìn)行，得不到完整的cDNA第一鏈，常常缺少其5′末端序列[13-14]。筆者使用DNAMAN軟件預(yù)測了牛BPI基因RNA的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其是由多個三葉草型莖環(huán)交聯(lián)形成的復(fù)雜牢固結(jié)構(gòu)。牛和羊均為反芻動物，在分類學(xué)上為同一科的動物，其基因結(jié)構(gòu)相似性較高，推斷本試驗(yàn)使用RACE技術(shù)擴(kuò)增不出巴什拜羊的BPI5′ 端序列，可能正是由于該基因mRNA某些區(qū)段形成了復(fù)雜牢固的二級結(jié)構(gòu)，阻礙了反轉(zhuǎn)錄的正常進(jìn)行，從而導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。因此，在重新進(jìn)行試驗(yàn)時，考慮到RNA二級結(jié)構(gòu)對反轉(zhuǎn)錄的影響，利用高溫有利于打開RNA二級結(jié)構(gòu)這一特點(diǎn)，將試劑盒說明中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件增加了一個步驟，即先在70 ℃處理5 min然后再驟冷處理，最后終于成功擴(kuò)增出5′末端序列片段。

本研究應(yīng)用RACE技術(shù)首次成功克隆了巴什拜羊BPI基因全長cDNA序列，并對BPI基因進(jìn)行了簡單的信息分析，從而對巴什拜羊的BPI有了進(jìn)一步的認(rèn)識。然而要更深入地了解BPI蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，還需要對其構(gòu)建表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，以進(jìn)一步開展巴什拜羊BPI的相關(guān)功能研究，揭示BPI蛋白在免疫中發(fā)揮的作用。

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Cloning and sequence analysis of Bactericidal/Permeability-Increasing protein gene in Xinjiang Baishibai sheep

YANG Wena,SHEN Wena,GUO Hai-yinga,CHEN Dong-meia,CHEN Kai-lib,SUN Yan-minga

(aCollegeofAnimalScienceandTechnology,bCollegeofLifeSciences,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China)

【Objective】 To reveal the bactericidal/permeability-increasing protein (BPI) in Bashibai sheep and improve the study of its structure and function,theBPIcDNA was cloned from Bashibai sheep by homologous cloning and rapid amplification cDNA ends (RACE).【Method】 This study used Bashibai sheep as the research object.First,merger primers were designed according to the cDNA sequence ofBostautusBPIgene from the GenBank andBPIgene segment was amplified by RT-PCR.The sequencing results were compared with known results.Second,according toBPIgene sequence,new primers were designed to extend the segments from the 5′ and 3′ ends,respectively.Then the cloned fragments were recycled and ligated into pMD18-T vector before being transformed into DH5α.At last,masculine clones were detected and sequence analysis was conducted.【Result】 The porcineBPIcDNA cloned was 1 922 bp in length (GenBank accession No:KF523344) and the open reading frame was 1 452 encoding 483 amino acids.BLAST analysis shows that homology ofBPIamino acids sequence between Bashibai sheep and those ofOvisaries,Bostaurus,Orcinusorca,Susscrofa,HomosapiensandOryctolaguswere 99%,91%,78%,74%,64%,61%,58%,53% and 50%,respectively.Molecular phylogenetic tree analysis shows that Bashibai sheep assembled toOvisaries,followed by bos,which was identical to the biological classification.【Conclusion】 Sheep BashibaiBPIcDNA with length of 1 922 bp was successfully cloned using RACE method and the phylogenetic tree result was consistent with the biological classification.

Bashibai sheep;BPIgene;bactericidal/permeability-increasing protein(BPI);rapid amplification cDNA ends (RACE)

2013-11-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160525)

楊 文(1989-),女,新疆石河子人,在讀碩士,主要從事獸醫(yī)臨床學(xué)研究。E-mail:yangwen2695@126.com

孫延鳴(1965-),男，新疆石河子人，教授，博士，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail:sym@shzu.edu.cn

時間:2015-04-13 12:59

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.05.028

S826.2

A

1671-9387(2015)05-001-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150413.1259.028.html