林建城，王國(guó)玲，閔志勇

(莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100)

日本鰻鱺腸道蛋白酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究

林建城，王國(guó)玲，閔志勇

(莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100)

【目的】 從日本鰻鱺(Anguillajaponica)腸道中分離純化蛋白酶并分析其酶學(xué)性質(zhì)，為日本鰻鱺飼料的科學(xué)研制提供理論依據(jù)?！痉椒ā?通過硫酸銨沉淀分級(jí)分離及Sephadex G-100和Sephadex G-75兩級(jí)凝膠柱層析純化日本鰻鱺腸道蛋白酶，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和SDS-PAGE鑒定蛋白酶純度和亞基分子質(zhì)量，利用凝膠層析法測(cè)定酶的分子質(zhì)量，用等電聚焦電泳法測(cè)定酶的等電點(diǎn)，并研究以酪蛋白為底物時(shí)蛋白酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)及pH、溫度、金屬離子和修飾劑對(duì)蛋白酶活力的影響?！窘Y(jié)果】 日本鰻鱺腸道蛋白酶亞基分子質(zhì)量為65.3 ku，酶分子質(zhì)量為260.3 ku，等電點(diǎn)為8.23；該蛋白酶的最適pH為8.2，最適溫度為55 ℃，米氏常數(shù)(Km)為4.832 mg/mL，最大反應(yīng)速度(Vmax)為0.269 U/min。日本鰻鱺腸道蛋白酶在pH 為6.6～9.0時(shí)表現(xiàn)穩(wěn)定，在20～55 ℃時(shí)具有較好的熱穩(wěn)定性，在60 ℃以上穩(wěn)定性迅速下降。Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+和Hg2+對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶的活力表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中以Hg2+的抑制作用最強(qiáng)，1 mmol/L Hg2+可使酶活力喪失 87.63%；而Fe2+有激活作用，5 mmol/L Fe2+可使酶活力提高134.53%。修飾劑EDTA、對(duì)氯汞苯甲酸(pCMB)和Cys對(duì)酶活力沒有影響，苯甲酰基磺酰氟(PMSF)和二硫蘇糖醇(DTT)對(duì)酶活力則有不同程度的抑制作用。【結(jié)論】 日本鰻鱺腸道蛋白酶由4條相同肽鏈組成，屬于絲氨酸蛋白酶類，二硫鍵是維持其活性所必需的，酶活力易受環(huán)境中酸堿度、溫度和金屬離子調(diào)控。

日本鰻鱺；蛋白酶；分離純化；酶學(xué)性質(zhì)

日本鰻鱺(Anguillajaponica)又稱河鰻，隸屬于鰻鱺目鰻鱺科，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是福建、廣東等南部省份的主要養(yǎng)殖魚類之一。鰻鱺是一種廣鹽性魚類，在海水中繁殖、淡水中生長(zhǎng)。幼鰻攝食水中的撓足類幼蟲、水蚤及小蝦等，成鰻則以小魚蝦、水生昆蟲為食，人工飼養(yǎng)條件下，則主要攝食人工配合飼料。

隨著鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，鰻鱺飼料種類繁多，可分為單一飼料、配合飼料和混合飼料等幾種。單一飼料中有的以供能為主，如以蛋白質(zhì)為主的單一飼料中蛋白質(zhì)含量在50%左右；有的以供給礦物質(zhì)或維生素等為主。配合飼料則是由飼料添加劑、蛋白質(zhì)飼料、礦物質(zhì)飼料和能量飼料等不同類別的營(yíng)養(yǎng)組配而成，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值完全的飼料產(chǎn)品。而與配合飼料相比，混合飼料中一般缺乏如微量元素、合成氨基酸、維生素和抗氧化劑等飼料添加劑。各種飼料均可能對(duì)鰻鱺蛋白酶的消化生理產(chǎn)生影響，而消化道蛋白酶活力的變化又會(huì)直接影響鰻鱺的生長(zhǎng)發(fā)育及其對(duì)飼料的利用。目前，已有研究者就不同養(yǎng)殖模式、生長(zhǎng)階段、飼料和養(yǎng)殖環(huán)境等[1-4]對(duì)鰻鱺消化道蛋白酶活性的影響進(jìn)行了研究。王志錚等[1]研究了池塘專養(yǎng)、日本沼蝦套養(yǎng)以及水庫放養(yǎng)等3種養(yǎng)殖模式對(duì)日本鰻鱺臟器消化酶的影響，發(fā)現(xiàn)以池塘專養(yǎng)養(yǎng)殖方式(屬“飽食寡動(dòng)型”的攝食方式)養(yǎng)殖的鰻鱺，其肝臟、腸、胰腺和胃的蛋白酶活力大，而以水庫放養(yǎng)方式(屬“寡食追逐型”的攝食方式)養(yǎng)殖的日本鰻鱺相應(yīng)臟器的蛋白酶活力均較小。Chiu等[2]比較研究了2個(gè)不同生長(zhǎng)階段日本鰻鱺胃蛋白酶活力，結(jié)果表明幼鰻胃蛋白酶活力比成鰻高1.5～2.0倍。陳度煌等[3]研究了不同飼料對(duì)莫桑比克鰻鱺(Anguillamossambica)消化酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)添加動(dòng)物性蛋白飼料飼喂的鰻鱺胃蛋白酶活性整體較強(qiáng)，證明肉食性魚類的消化道蛋白酶活性較雜食性和草食性魚類強(qiáng)。此外，有關(guān)飼料對(duì)其他魚類蛋白酶活力的影響也有較深入的研究。高梅等[5]研究發(fā)現(xiàn)，南方鲇(SilurusmeridionalisChen)攝取碳水化合物飼料后，幼魚胰蛋白酶活性顯著提高，說明碳水化合物飼料會(huì)引起南方鲇蛋白酶活性的改變。而賈景濤等[6]研究表明，羅非魚(Oreochromisniloticus)腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶對(duì)飼料鎘的敏感程度不同，飼料鎘對(duì)蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制作用。雖然這些研究為鰻鱺飼料的合理配制與使用提供了一定的借鑒，但目前尚未見關(guān)于日本鰻鱺腸道蛋白酶分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)的研究報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以日本鰻鱺腸道為原料提取蛋白酶，并研究其酶學(xué)性質(zhì)，旨在為日本鰻鱺飼料的合理研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

日本鰻鱺來自莆田市東源食品有限公司，選擇體長(zhǎng)(43±2) cm的無病害活鰻30條，停食24 h后解剖，剔除肝臟、脂肪等附著物，取其小腸部分，清洗瀝干后，將每條日本鰻鱺小腸裝入一樣品袋，于-18 ℃下冷凍貯存，待用。

Sephadex G-200、G-100和G-75均為Pharmacia產(chǎn)品；牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；電泳使用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白(19～117 ku)及測(cè)定蛋白酶分子質(zhì)量使用的甲狀腺球蛋白(TRG 670.0 ku)、λ球蛋白(GBL 150.0 ku)、牛白蛋白(BSA 67.0 ku)、雞卵蛋白(OA 45.0 ku)和辣根過氧化物酶(HRP 44.0 ku)、DH020-1載體兩性電解質(zhì)，均為天根生化科技有限公司出品；對(duì)氯汞苯甲酸(pCMB)和苯甲?；酋７?PMSF)為Sigma產(chǎn)品；二硫蘇糖醇(DTT)和半胱氨酸(Cys)等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方 法

1.2.1 蛋白酶的分離純化 隨機(jī)取3袋日本鰻鱺小腸，解凍后切成1 cm小段，從每個(gè)樣品袋中等量取樣，共150 g，加入450 mL預(yù)冷的0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，10 000 r/min下?lián)v碎勻漿1 min，4 ℃抽提4 h以上，30 000×g冷凍離心30 min，取上清液。依次采用體積分?jǐn)?shù)30%和70%飽和硫酸銨分級(jí)分離酶蛋白，收集沉淀物透析后冷凍離心(45 000×g) 30 min，得粗酶制劑。再分別經(jīng)過Sephadex G-100和G-75分子篩凝膠柱 (柱規(guī)格均為2.6 cm×60 cm) 層析純化。2個(gè)柱層析的洗脫液均為0.075 mol/L Tris-HCl緩沖液(含0.2 mol/L NaCl)，Sephadex G-100柱層析流速為0.4 mL/min，自動(dòng)部分收集器收集流出液，按每管4 mL收集，收集80管，集中有酶活力的收集管，收集液用于Sephadex G-75柱層析；Sephadex G-75柱層析流速為0.5 mL/min，每管收集5 mL，同樣收集80管，集中有酶活力的收集管，收集液用于酶蛋白的純度鑒定和酶學(xué)性質(zhì)研究。

蛋白濃度測(cè)定采用Bradford[7]的方法進(jìn)行，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；分離純化過程中，各收集管內(nèi)溶液蛋白濃度以波長(zhǎng)280 nm處紫外吸收的吸光度(OD280 nm)表示。

采用SDS-PAGE測(cè)定蛋白酶亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，采用10.0%分離膠和3.0%濃縮膠進(jìn)行電泳，使用考馬斯亮藍(lán)R250染色，確定酶的純度。從SDS-PAGE電泳圖譜求各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的相對(duì)遷移率，以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率(以變量x表示)與相應(yīng)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(以變量y表示)作圖，回歸方程為：y=-2.216x+5.460。

1.2.2 蛋白酶活力的測(cè)定 蛋白酶活力測(cè)定參照文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。在2 mL測(cè)定體系中加入體積分?jǐn)?shù)2%酪蛋白底物0.5 mL、0.075 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5) 0.5 mL、雙蒸餾水0.95 mL及酶液50 μL，55 ℃下反應(yīng)20 min，加入3 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的三氯乙酸(TCA)終止反應(yīng)，3 000 r/min離心10 min，取上清液在Backman DU2650型紫外分光光度計(jì)上測(cè)定其OD280 nm。以先加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸(TCA)、后加酶液為空白對(duì)照。將1個(gè)酶活力單位(U)定義為：每min產(chǎn)生1 μmol/L酪氨酸所需要的酶量。酶比活力的單位為U/mg。

1.2.3 蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì) 1)分子質(zhì)量的測(cè)定。采用Sephadex G-200凝膠層析法[9](柱規(guī)格為2.6 cm×60 cm)，選用甲狀腺球蛋白、λ球蛋白、牛白蛋白和雞卵蛋白及辣根過氧化物酶5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以5種標(biāo)準(zhǔn)蛋白的洗脫體積對(duì)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；根據(jù)待測(cè)純酶的洗脫體積，求算蛋白酶的分子質(zhì)量。

2)等電點(diǎn)的測(cè)定。采用等電點(diǎn)聚焦電泳法[9]測(cè)定。

1.2.4 pH對(duì)蛋白酶活力的影響 測(cè)定不同pH(3.6，4.0，5.0，5.6，5.8，6.0，6.6，7.0，7.4，7.8，8.0，8.2，8.6，9.0，9.4，10.0，10.6)時(shí)的蛋白酶活力，確定其最適pH。其中pH 為3.0～7.0時(shí)選擇檸檬酸-Na2HPO4緩沖液，pH為7.4～8.6時(shí)使用Tris-HCl 緩沖液，pH為9.0～10.6時(shí)使用甘氨酸-NaOH緩沖液，緩沖液濃度均為0.15 mol/L。然后將酶液分別與各種緩沖液混合，4 ℃下處理1 h，在最適pH下測(cè)定酶活力，分析蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性。以試驗(yàn)組最大酶活力為100%，其他試驗(yàn)組以相對(duì)酶活力表示。

1.2.5 溫度對(duì)蛋白酶活力的影響 檢測(cè)不同溫度(20，30，40，45，50，55，60，65，70，80，90 ℃)下蛋白酶的活力，確定其最適溫度。再將蛋白酶液置于不同溫度下處理1 h，然后取50 μL處理過的酶，在最適溫度下檢測(cè)其酶活力，分析酶的溫度穩(wěn)定性。以試驗(yàn)組最大酶活力為100%，其他試驗(yàn)組以相對(duì)酶活力表示。

1.2.6 金屬離子和修飾劑對(duì)蛋白酶活力的影響 在蛋白酶活力的測(cè)定體系中，分別加入MgCl2、CaCl2、CoCl2、BaCl2、MnCl2、Cu2SO4和ZnSO4，使其最終濃度為100 mmol/L，或者加入1 mmol/L HgCl2或5 mmol/L FeSO4，測(cè)定加入各金屬離子后的蛋白酶活力。再以同樣的方法分別加入10 mmol/L DTT、0.1 mmol/L PMSF、10 mmol/L pCMB、10 mmol/L Cys和100 mmol/L EDTA修飾劑，測(cè)定加入修飾劑后的蛋白酶活力。以未添加金屬離子和修飾劑的對(duì)照組酶活力為100%，測(cè)定各試驗(yàn)組的相對(duì)酶活力。

1.2.7 蛋白酶水解底物酪蛋白的動(dòng)力學(xué)分析 在蛋白酶活力測(cè)定體系中，改變酪蛋白底物的質(zhì)量濃度，測(cè)定底物質(zhì)量濃度分別為1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，4.5，5.0 mg/mL時(shí)的酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法求取蛋白酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速度(Vmax)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本鰻鱺腸道蛋白酶的分離純化

日本鰻鱺腸道經(jīng)勻漿抽提，用體積分?jǐn)?shù)30%和70%飽和硫酸銨分級(jí)分離、透析離心后得到蛋白酶粗酶制劑，經(jīng)過Sephadex G-100分子篩柱層析分離純化，出現(xiàn)3個(gè)蛋白質(zhì)吸收峰(圖1)，但只有第2個(gè)蛋白峰周圍具有蛋白酶活性，收集酶活力峰；再經(jīng)Sephadex G-75分子篩柱層析分離，去除雜蛋白，只出現(xiàn)1個(gè)蛋白峰(圖2)，收集酶活力峰，最終得到純化倍數(shù)為18.12、酶比活力為104.01 U/mg的蛋白酶制劑。由表1的各步分離純化結(jié)果可知，每經(jīng)一步純化，收集到的蛋白酶比活力不斷提高，純化倍數(shù)不斷增大，說明純化過程中雜蛋白逐漸被去除，純化倍數(shù)較高，最終蛋白酶得率達(dá)到42.01%，說明該純化方案有效可行。

純化后的蛋白酶制劑經(jīng)PAGE鑒定為單一蛋白質(zhì)成分(圖3-A)，說明該酶制劑達(dá)到電泳純要求。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果(圖3-B)表明，分離純化獲得了單一的日本鰻鱺腸道純蛋白酶制劑。

根據(jù)蛋白酶的相對(duì)遷移率，求得蛋白酶亞基分子質(zhì)量為65.3 ku。單一的日本鰻鱺腸道純蛋白酶通過凝膠柱層析后的洗脫體積為104.5 mL，蛋白酶的分子質(zhì)量為260.3 ku，等電點(diǎn)為8.23。

2.2 pH對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶活力的影響

圖4顯示，pH值對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶酶活力的影響呈鐘罩型曲線變化，蛋白酶最適pH值為8.2。為分析該蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性，將其在不同pH下處理1 h后，結(jié)果表明蛋白酶在pH 6.6～9.0區(qū)域內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，經(jīng)pH 10.0緩沖液處理后相對(duì)酶活力僅有10.1%，而在pH 6.0以下處理1 h后酶失活加速，說明該蛋白酶對(duì)酸、堿均比較敏感。

2.3 溫度對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶活力的影響

由圖5可見，日本鰻鱺腸道蛋白酶催化酪蛋白水解的最適溫度為55 ℃，溫度升高到65 ℃以后酶活力迅速下降，溫度達(dá)80 ℃時(shí)酶活力僅有13.8%。進(jìn)一步考察蛋白酶在不同溫度下處理1 h后的酶活力，結(jié)果表明，在20～55 ℃處理1 h后相對(duì)酶活力還保持在82%以上，表明日本鰻鱺腸道蛋白酶在此溫度區(qū)間具有較好的熱穩(wěn)定性；但在70 ℃下處理1 h相對(duì)酶活力僅為16.1%，90 ℃下處理1 h后酶接近失活。

2.4 金屬離子和修飾劑對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶活力的影響

從表2可知，在本試驗(yàn)條件下，100 mmol/L的Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+和Zn2+可分別使日本鰻鱺腸道蛋白酶活力喪失3.64%，28.80%，43.30%，45.80%，57.04%，92.42%和96.20%；Fe2+對(duì)酶活力有較強(qiáng)的激活作用，5 mmol/L Fe2+可使酶活力提高134.53%；Hg2+對(duì)蛋白酶有強(qiáng)烈的抑制作用，1 mmol/L Hg2+可使酶活力喪失87.63%。上述結(jié)果說明，除了Fe2+外，其余8種金屬離子對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶活力均有不同程度的抑制作用，Mg2+和Ca2+對(duì)蛋白酶活力影響較小，重金屬離子Cu2+和Zn2+對(duì)蛋白酶的抑制作用較強(qiáng)，Hg2+的抑制作用最強(qiáng)。從表2還可知，金屬蛋白酶類抑制劑EDTA對(duì)蛋白酶活力沒有影響，說明日本鰻鱺腸道蛋白酶的活性中心不含金屬離子，屬非金屬蛋白酶；巰基修飾劑pCMB和巰基化合物Cys對(duì)蛋白酶活性幾乎無影響，說明日本鰻鱺腸道蛋白酶不是巰基蛋白酶； DTT與PMSF對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其中PMSF的抑制作用最強(qiáng)。由于PMSF是絲氨酸蛋白酶抑制劑，DTT是二硫鍵的修飾劑，說明日本鰻鱺腸道蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，二硫鍵對(duì)蛋白酶活性的維持是必需的。

2.5 日本鰻鱺腸道蛋白酶水解底物酪蛋白的動(dòng)力學(xué)分析

在蛋白酶水解底物酪蛋白質(zhì)量濃度1.5～5.0 mg/mL時(shí)，測(cè)定日本鰻鱺腸道蛋白酶的活力，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)(y)與反應(yīng)速度的倒數(shù)(x)作圖，回歸得到直線方程為y=17.965x+3.718，求得蛋白酶的米氏常數(shù)(Km)為4.832 mg/mL，最大反應(yīng)速度(Vmax)為 0.269 U/min。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日本鰻鱺小腸蛋白酶亞基分子質(zhì)量為65.3 ku，而其蛋白酶分子質(zhì)量為260.3 ku，由此可以推斷，日本鰻鱺蛋白酶可能由4條相同肽鏈組成。不同魚類蛋白酶亞基組成及其大小不同。黃鱔(MonopterusalbusZuiew)[10]和大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)[11]腸道蛋白酶亞基分子質(zhì)量分別為25.5和58 ku，而青魚(Mylopharyngodonpiceus)[12]和星鯊(Mustelusmustelus)[13]胰蛋白酶亞基分子質(zhì)量分別為44和24 ku，黃鱔腸道蛋白酶和青魚胰蛋白酶均由1條肽鏈組成，說明日本鰻鱺腸道蛋白酶亞基組成數(shù)量較多，相對(duì)分子質(zhì)量也較大。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日本鰻鱺腸道蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，而胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶家族的消化酶，因此推斷日本鰻鱺腸道蛋白酶應(yīng)是一種胰蛋白酶。黃鱔[10]內(nèi)臟蛋白酶和奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)[14]腸道胰蛋白酶也是絲氨酸蛋白酶，而大菱鲆[11]腸道蛋白酶是一種巰基蛋白酶，青魚[12]胰蛋白酶則是一種金屬蛋白酶。

本研究結(jié)果表明，日本鰻鱺腸道蛋白酶的最適反應(yīng)pH為8.2，在pH 6.6～9.0內(nèi)可以保持較高活性，等電點(diǎn)偏堿性，因此推測(cè)其為堿性蛋白酶。草魚(Ctenopharyngodonidellus)[15]和北極沙丁魚(Sardinellaaurita)[16]胰蛋白酶(A、B、C)最適pH均為9.0，星鯊[13]和新金槍魚(Thunnustonggol)[17]胰蛋白酶最適pH則是8.5，而暗紋東方鲀(Fuguobscurus)[18]胃蛋白酶最適pH為2.5；Chiu等[2]研究了日本鰻鱺幼鰻和成鰻的2種胃蛋白酶PⅠ和 PⅡ，PⅠ在幼鰻和成鰻中的最適pH分別為1.5和2.5，PⅡ在幼鰻和成鰻中的最適pH均為3.5，2種胃蛋白酶的最適pH均偏酸性。本研究中，日本鰻鱺腸道蛋白酶在pH 6.6～9.0內(nèi)穩(wěn)定，在pH 8.6下處理1 h后，蛋白酶活力還有91.7%；但在pH 10.0的緩沖液中處理1 h后，蛋白酶活力只有 10.1%。日本鰻鱺成鰻適宜在pH 7.2～9.0的水體中生長(zhǎng)[19]，與星鯊[13]胰蛋白酶的穩(wěn)定酸堿度 (pH 7.0～9.0)相近。黃鰭金槍魚(Thunnusalbacores)[20]胰蛋白酶(A、B)在pH 6～11內(nèi)穩(wěn)定；青魚[12]胰蛋白酶也具有耐堿性，在pH 7～10下放置5 h之后仍然有80%以上的活力；黃鱔[10]腸道蛋白酶是耐堿蛋白酶，在pH 12下室溫處理5 h，活力還有55%。而樊海平等[21]發(fā)現(xiàn)，在20 ℃水體中，雙色鰻鱺(Anguillabicolor)適宜生長(zhǎng)的pH為4.0～9.0，體現(xiàn)出更強(qiáng)的耐酸能力。

桂遠(yuǎn)明等[22]研究報(bào)道，鰱、鳙、草魚、鯉魚腸和肝胰臟蛋白酶較適溫度為45～55 ℃。另有研究表明，美洲鰻[4]肝胰臟蛋白酶的最適溫度則為50 ℃，草魚[15]酸性蛋白酶的最適溫度為37 ℃，新金槍魚[17]胰蛋白酶的最適溫度則為65 ℃，而斑點(diǎn)叉尾鮰魚(Ictaluruspunctatus)[23]胰蛋白酶(A)和北極沙丁魚[16]內(nèi)臟胰蛋白酶(A、C)的最適溫度均為55 ℃，與本試驗(yàn)中日本鰻鱺腸道蛋白酶的最適溫度相同。

不同魚類蛋白酶的熱穩(wěn)定性不同。大菱鲆[11]蛋白酶在60 ℃時(shí)保溫30 min后酶活力完全喪失，青魚[12]胰蛋白酶在55 ℃條件下水浴1 h，活力僅有20%。本研究表明，日本鰻鱺腸道蛋白酶在55 ℃下處理1 h后，酶活力還有82.1%，說明日本鰻鱺蛋白酶具有較好的熱穩(wěn)定性。魚類棲息水域的溫度一般較魚蛋白酶的最適溫度低，有研究發(fā)現(xiàn)日本鰻鱺生長(zhǎng)的適宜水溫為13～30 ℃[19]。本研究于離體條件下測(cè)定的日本鰻鱺腸道蛋白酶的較適溫度并不在此范圍內(nèi)，原因可能是自然水溫下生長(zhǎng)的鰻鱺腸道蛋白酶由于對(duì)底物進(jìn)行了較長(zhǎng)時(shí)間的酶解作用，導(dǎo)致酶最適溫度下降，以適應(yīng)其生存的水環(huán)境。所以離體條件下測(cè)定的酶最適溫度會(huì)出現(xiàn)偏差,今后應(yīng)著重研究飼養(yǎng)水溫對(duì)日本鰻鱺消化道蛋白酶活力的影響。

本試驗(yàn)結(jié)果還表明，Mg2+、Ca2+、Co2+、Ba2+、Mn2+、Cu2+、Zn+、Hg2+等8種金屬離子對(duì)日本鰻鱺腸道蛋白酶均有不同程度的抑制作用，而Fe2+卻表現(xiàn)出較大的激活作用，這與葉玫等[24]有關(guān)Mg2+和Ca2+對(duì)鰻鱺蛋白酶有一定激活作用的研究結(jié)果不同。此外，Cu2+和Zn2+能顯著抑制大菱鲆[11]的腸蛋白酶活性，而Mn2+對(duì)其又有明顯的激活作用；Ca2+、Mn2+和Mg2+對(duì)暗紋東方鲀[18]蛋白酶有明顯的激活作用，Zn2+和Fe2+對(duì)該酶又表現(xiàn)出抑制作用；于國(guó)英等[25]研究表明，Mg2+和Ca2+對(duì)鮐魚消化道蛋白酶有激活作用，但Cu2+、Co2+和Hg2+對(duì)其又表現(xiàn)為抑制作用。說明水中的金屬離子及配合飼料中添加的礦物質(zhì)均可對(duì)蛋白酶活力產(chǎn)生影響，因此在配合飼料中添加礦物質(zhì)時(shí)要注意控制添加量，以免使鰻鱺腸道蛋白酶的活性降低，影響其對(duì)蛋白質(zhì)的消化與吸收。目前對(duì)鰻鱺配合飼料中微量元素的添加量尚無系統(tǒng)研究[26]，具體的添加量應(yīng)根據(jù)飼養(yǎng)試驗(yàn)來進(jìn)一步確定。

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Purification of protease from intestine ofAnguillajaponicaand its enzymatic characteristics

LIN Jian-cheng,WANG Guo-ling,MIN Zhi-yong

(CollegeofEnvironment&BiologicalEngineering,PutianUniversity,Putian,Fujian351100,China)

【Objective】 This study purified protease from intestine ofAnguillajaponicaand investigated its enzymatic characteristics to provide theoretical basis in scientific development of the diet forAnguillajaponica.【Method】 The protease was purified by ammonium sulfate fractionation and Sephadex G-100 and Sephadex G-75 columns.The purity was determined by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE.Enzyme molecular weight was determined by gel chromatography,and isoelectric point was determined by isoelectric focusing method.The kinetic parameters of protease for hydrolysis of casein (enzyme substrate) and effects of 9 ions and modifiers were also determined.【Result】 The molecular weight of enzyme was 260.3 ku and the molecular of enzyme subunit was 65.3 ku.The isoelectric point value was 8.23.The optimum pH and temperature were 8.2 and 55 ℃,respectively.TheKmvalue was 4.832 mg/mL and theVmaxvalue was 0.269 U/min,respectively.The enzyme was stable with pH of 6.6 to 9.0 and temperature of 20-55 ℃.The stability of enzyme dropped rapidly when temperature was >60 ℃.Fe2+activated the enzyme,and the activity was increased by 134.53% when the concentration of Fe2+was 5 mmol/L.Mg2+,Ca2+,Co2+,Ba2+,Mn2+,Cu2+,Zn2+and Hg2+showed various degrees of inhibitory effects on the enzyme.Hg2+inhibited the enzyme the most,and the enzyme activity decreased by 87.63% when its concentration reached 1 mmol/L.EDTA,p-chloromercuribenzoate and cysteine had no influence on the enzyme,while benzoyl sulfonyl fluoride and dithiothreitol inhibited the enzyme.【Conclusion】 The protease from intestine ofAnguillajaponicacontained four peptide chains with same mass.The enzyme was a serine proteinase and the disulfide bonds were essential for the active site of protease.The activity of protease was affected easily by acidity-alkalinity,temperature and metal ions.

Anguillajaponica;protease;purification;enzymatic characteristics

2013-09-09

福建省區(qū)域科技重大項(xiàng)目(2009N3002)

林建城(1966-)，男，福建莆田人，教授，碩士，主要從事海洋生物酶學(xué)研究。E-mail:ptljc660402@sina.com

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.032

Q556+.3

A

1671-9387(2015)01-0045-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.032.html