羅 瑩，周冠宇，馮士彬，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

中藥提取物對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及總蛋白含量的影響

羅 瑩，周冠宇，馮士彬，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

【目的】 研究中藥復(fù)方灌注液及其中的單味中藥提取物對(duì)原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及總蛋白含量的影響?！痉椒ā?采用原代組織塊貼壁法獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞，以質(zhì)量濃度為5，10，15和20 mg/mL的中藥復(fù)方灌注液以及紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子提取物，分別作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，確定最適宜中藥質(zhì)量濃度，采用該質(zhì)量濃度提取物處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺上皮細(xì)胞，并分別在處理的1，3和5 d時(shí)取樣，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞活性，并測(cè)定細(xì)胞分泌的總蛋白含量?！窘Y(jié)果】 通過組織塊貼壁與胰蛋白酶消化法相結(jié)合，得到較純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。澤蘭、雞血藤、復(fù)方灌注液在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)能極顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖(P<0.01)，澤蘭、雞血藤、訶子、復(fù)方灌注液在質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)能極顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞總蛋白的含量(P<0.01)?！窘Y(jié)論】 適宜質(zhì)量濃度的中藥作用于奶牛乳腺上皮細(xì)胞，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)及其總蛋白的分泌。

奶牛乳腺上皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；中藥提取物；總蛋白

體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞開始于1957年，在此后的幾十年間，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了廣泛而深入的研究。2002年，Barash等[1]建立了體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞系L-1和H-7，并指出L-1細(xì)胞能形成乳腺管狀結(jié)構(gòu)，而H-7細(xì)胞則可形成球狀結(jié)構(gòu)。2006年，崔立莉[2]從泌乳中后期健康的荷斯坦奶牛的乳汁中也得到了乳腺上皮細(xì)胞，并探討了亞油酸和維生素A對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的影響。體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞對(duì)研究正常乳腺發(fā)育以及體外各種因素對(duì)乳腺發(fā)育的影響具有重要意義。

中藥是純天然物質(zhì)，含有生物堿、萜類、黃酮、皂苷等多種生物活性成分，兼有藥物與營(yíng)養(yǎng)雙重功能，且資源豐富，價(jià)格低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景，日益為國(guó)內(nèi)外專家所關(guān)注。目前，有關(guān)采用中藥制劑治療奶牛乳房炎的報(bào)道較多。王飛等[3]使用“消炎增乳散”對(duì)奶牛隱性乳房炎進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)其治愈率高達(dá)72.2%；周學(xué)輝[4]應(yīng)用“速效乳炎散”治療奶牛乳腺炎，也起到了相當(dāng)好的療效。本實(shí)驗(yàn)室研制了治療奶牛乳房炎的中藥復(fù)方灌注液，取得了較好的臨床效果[5-6]。為進(jìn)一步探明該中藥復(fù)方灌注液治療乳房炎的機(jī)制，本試驗(yàn)以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，將中藥復(fù)方灌注液及其單味中藥提取液直接作用于細(xì)胞，觀察其對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖和總蛋白分泌的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本與中藥 奶牛乳腺組織取自安徽省合肥市屠宰場(chǎng)屠宰后的健康經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛。中藥紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子，均購(gòu)自安徽亳州濟(jì)人藥業(yè)。治療奶牛乳房炎的中藥復(fù)方灌注液(專利號(hào)：ZL 2010 1 0132974.7)，組分包括紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子、香附、青皮等。

1.1.2 主要試劑 DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)和2.5 g/L胰蛋白酶(1×)溶液(Hyclone公司)，DPBS(Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)和二甲基亞砜(DMSO)(Solarbio公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)，總蛋白試劑盒(長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司)，瑞氏-吉姆薩染色試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器 SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，BB15型CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，GF-D200型半自動(dòng)生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)，Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀(Thermo 公司)。

1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

1.2.1 乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將奶牛乳腺組織用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沖洗1遍后放入托盤中帶入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。用手術(shù)剪剪取1 cm3大小的組織塊，放入含10×雙抗的DPBS中清洗3次。將組織塊移入2 mL離心管中，加入0.5 mL FBS，用眼科剪將組織盡量剪碎。用1 mL微量移液器吸出剪碎的組織塊均勻平鋪在6 cm的培養(yǎng)皿中，吸去多余液體，將培養(yǎng)皿倒置在CO2培養(yǎng)箱中。12 h后，倒置顯微鏡下觀察組織塊已貼壁后，補(bǔ)加含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液。此后每隔2 d換液。第8 天觀察細(xì)胞已達(dá)到95%匯合，用1 mL的2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化5 min，去除成纖維細(xì)胞，重復(fù)此步驟3次即可得到較為純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。待純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)，用1 mL的2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化10 min，倒置顯微鏡下觀察乳腺上皮細(xì)胞已經(jīng)基本消化下來后，加入3 mL含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化，離心去上清后，加入3 mL含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞按體積比1∶3傳代。

1.2.2 乳腺上皮細(xì)胞的染色 棄去第4代第5 天的乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)基，用DPBS清洗2遍，加入甲醇浸泡固定10 min，再按照瑞氏-吉姆薩染色試劑盒說明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

1.2.3 乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的SDS-PAGE電泳 收集第3代培養(yǎng)5 d的乳腺上皮細(xì)胞上清液，對(duì)乳腺上皮細(xì)胞特異分泌物β-酪蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，以奶牛β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 中藥提取物對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖及總蛋白含量的影響

1.3.1 中藥提取物的制備 中藥提取物的制備均采用溶劑萃取法，在超聲波萃取機(jī)中進(jìn)行。其中紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子用乙醇提取，復(fù)方灌注液用純水提取。提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中。

1.3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的測(cè)定 分別收集用質(zhì)量濃度為5，10，15，20 mg/mL(以生藥計(jì))的中藥提取物處理1 d的第5代第3天奶牛乳腺上皮細(xì)胞，以及用質(zhì)量濃度為10 mg/mL的中藥提取物處理1，3和5 d的第5代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力。對(duì)照組奶牛均不添加中藥。具體測(cè)定方法如下：將奶牛乳腺上皮細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)1 d后，每孔加入MTT(5 mg/mL PBS配制)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，選擇492 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光值。

1.3.3 乳腺上皮細(xì)胞總蛋白含量的測(cè)定 分別收集用質(zhì)量濃度為5，10，15，20 mg/mL的中藥提取物處理的第5代第3天奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液，以及用質(zhì)量濃度為15 mg/mL的中藥提取物處理1，3和5 d后的第5代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液，檢測(cè)總蛋白含量。對(duì)照組奶牛均不添加中藥。具體操作步驟按照總蛋白試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件ANOVA方法處理，LSD顯著性檢驗(yàn)。P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

奶牛乳腺組織塊貼壁后，到第7 天時(shí)細(xì)胞慢慢從組織塊中爬出(圖1-A)，匯合度已經(jīng)有50%～60%；純化后的第3代奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)5 d時(shí)，細(xì)胞呈鋪路石狀貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好(圖1-B)。

瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果(圖2)顯示，奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)以圓形為主，胞體肥大，胞漿豐滿。細(xì)胞質(zhì)疏松，著色較淺。細(xì)胞核較大，呈藍(lán)紫色，多為卵圓形，核仁明顯(圖2-A)。培養(yǎng)至第4代乳腺上皮細(xì)胞仍然保持了細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)的特性，大多數(shù)細(xì)胞有2～4個(gè)核仁(圖2-B)。

由圖3可見，奶牛β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量在26～33 ku，而奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液在同樣的位置也出現(xiàn)條帶，證明奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的過程中能夠產(chǎn)生β-酪蛋白。

圖3 第3代奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果
A.分子質(zhì)量14.4～94.0 ku的Marker；B.β-酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；C.乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液
Fig.3 SDS-PAGE of bovine mammary epithelial cells’ β-CN
A.14.4-94.0 ku Marker;B.β-CN standard;C.Medium of mammary epithelial cells

2.2 中藥提取物對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

不同質(zhì)量濃度中藥提取物對(duì)第5代奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響見表1。由表1可見，采用不同質(zhì)量濃度中藥提取物作用奶牛乳腺上皮細(xì)胞1 d后，與對(duì)照組相比，紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤和復(fù)方灌注液對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用不明顯(P>0.05)，而訶子在質(zhì)量濃度為10，15和20 mg/mL時(shí)均能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)，但由于標(biāo)準(zhǔn)差大，測(cè)定結(jié)果不可靠。紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤和復(fù)方灌注液在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)OD492 nm值較大，所以選用質(zhì)量濃度為10 mg/mL的紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤和復(fù)方灌注液處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞，研究不同中藥處理細(xì)胞1,3,5 d后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果見圖4。

注：表中數(shù)據(jù)為OD492 nm值；數(shù)據(jù)后標(biāo)注“*”表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注“**”表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。 下表同。

Note:Data in the table represent OD492 nmvalue;“*” represents significant difference atP<0.05 compared with the control group;“**” represents extremely significant difference atP<0.01 compared with the control group.The same below.

由圖4可見，與對(duì)照組相比，10 mg/mL的紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤提取物和復(fù)方灌注液處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，紫花地丁和黃芪對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖作用不明顯(P>0.05)；澤蘭和雞血藤?gòu)牡? 天開始能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)，而中藥復(fù)方灌注液在第5天時(shí)能極顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01)。

2.3 中藥提取物對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞總蛋白含量的影響

由表2可見，不同中藥提取物作用乳腺上皮細(xì)胞1 d后，與對(duì)照組相比，各質(zhì)量濃度紫花地丁提取物對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌總蛋白無顯著影響(P>0.05)；不同質(zhì)量濃度的澤蘭、雞血藤、訶子提取物和復(fù)方灌注液極顯著促進(jìn)細(xì)胞總蛋白分泌(P<0.01)；黃芪提取物極顯著抑制細(xì)胞總蛋白分泌(P<0.01)。在質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，各中藥組奶牛乳腺上皮細(xì)胞總蛋白含量最高，所以選用質(zhì)量濃度為15 mg/mL的紫花地丁、澤蘭、雞血藤、訶子提取物和復(fù)方灌注液處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞，研究不同中藥在處理細(xì)胞1，3，5 d對(duì)總蛋白含量的促進(jìn)作用，結(jié)果見圖5。

由圖5可見，15 mg/mL的紫花地丁、澤蘭、雞血藤、訶子提取物和復(fù)方灌注液處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，紫花地丁提取物對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞總蛋白含量無顯著影響(P>0.05)；澤蘭、雞血藤提取物和復(fù)方灌注液在第1天時(shí)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞總蛋白含量有極顯著影響(P<0.01)，且隨時(shí)間增加總蛋白含量增加，差異極顯著(P<0.01)。與對(duì)照組相比，訶子提取物在第1天時(shí)極顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞分泌總蛋白(P<0.01)；第3天總蛋白含量與第1 天相比極顯著下降(P<0.01)；第5天總蛋白含量同第3天相比極顯著增加(P<0.01)。

圖5 中藥提取物處理第5代奶牛乳腺上皮細(xì)胞總蛋白含量的比較
Fig.5 Comparison of total protein contents of the 5thgeneration bovine mammary epithelial cells after treatment with Chinese herbal extracts

3 討 論

早在1991年，Hansen等[7]證明，山羊乳腺上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下需要胰島素、氫化可的松和催乳素的刺激才能分泌β-酪蛋白。本試驗(yàn)通過組織塊貼壁法獲得純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并采用瑞氏-吉姆薩染色和β-酪蛋白SDS-PAGE法進(jìn)行鑒定[8-9]，證明所獲得細(xì)胞為生理機(jī)能正常的奶牛乳腺上皮細(xì)胞。但筆者在細(xì)胞培養(yǎng)過程中并沒有使用Hansen提出的胰島素、氫化可的松和催乳素。

奶牛乳房炎在中獸醫(yī)中屬于奶腫、奶黃、乳癰，該疾病的發(fā)生與胃熱壅滯和肝氣郁結(jié)[10]有關(guān)，治療奶牛乳房炎應(yīng)以活血化瘀、清熱解毒、消腫散結(jié)、痛經(jīng)下乳為原則[11]。目前，治療奶牛乳房炎的手段很多，最常用的是化學(xué)藥物治療，但是長(zhǎng)期使用化學(xué)藥物容易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性以及藥物殘留、污染環(huán)境等問題。近幾年，使用中藥治療奶牛乳房炎取得了很多成功經(jīng)驗(yàn)。董祿[12]使用中草藥制劑“瓜蔞散加減”來治療奶牛乳房炎，療效比較滿意。本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)“辯證施治”的原則，研制的治療奶牛乳房炎中藥復(fù)方灌注液臨床使用效果顯著[5-6]。該中藥復(fù)方灌注液組方中紫花地丁為主藥，具有清熱解毒、抗菌消炎、涼血消腫、益氣活血、散瘀止痛的作用；雞血藤、黃芪、澤蘭共為輔藥，具有補(bǔ)氣、補(bǔ)血、通經(jīng)活絡(luò)、托毒排膿的功能；訶子為使藥，具有養(yǎng)氣養(yǎng)血、清熱解毒、調(diào)和諸藥的作用。李定剛[13]的研究表明，紫花地丁中的有效成分七葉內(nèi)酯、東莨菪內(nèi)酯、茵陳素對(duì)奶牛乳房炎中主要致病菌鏈球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌等均有很好的抑菌效果，其中七葉內(nèi)酯的抑菌效果最好；丁月云[14]指出，20 mg/mL的黃芪可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，澤蘭、雞血藤、復(fù)方灌注液在質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)可極顯著促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖(P<0.01)，澤蘭、雞血藤、訶子、復(fù)方灌注液在質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)可極顯著提高乳腺上皮細(xì)胞總蛋白的含量(P<0.01)，而紫花地丁對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖和蛋白分泌無顯著作用。訶子對(duì)于細(xì)胞分泌總蛋白具有顯著的促進(jìn)作用，但訶子中的某些成分與DMSO發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的黑色物質(zhì)不利于細(xì)胞吸光度的測(cè)定，故無法判斷訶子是否能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。

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Ding Y Y.Study on the effects of extracts ofSemanvaccaria,Astragalusmembranaceuson the proliferation results and secretion function of cow mammary epithelial cells culturedinvitro[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2008.(in Chinese)

Effects of Chinese herbal extracts on proliferation and total protein content of cow mammary gland epithelial cells

LUO Ying,ZHOU Guan-yu,FENG Shi-bin,WANG Xi-chun,WU Jin-jie

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 The purpose of this experiment was to study the effects of Chinese herbal compound perfusion and the single herbal extracts on proliferation and total protein content of cow mammary gland epithelial cells.【Method】 Purified cow mammary gland epithelial cells were obtained by using the original organization block adherent method,and the Chinese herbal compound perfusion and extracts of major constituents(Herbviolae,Radixastragali,Herbalycopi,Herbapaederiae,andFructuschebulae) were prepared.Different levels (5,10,15 and 20 mg/mL) of compound perfusion and extracts were used to treat mammary gland epithelial cells of cows at exponential growth stage.The optimum effective concentration of compound perfusion was determined and was used to treat cow mammary gland epithelial cells.Then,the cell activities were measured by MTT method and TP values were detected at 1,3 and 5 d.【Result】 Purified cow mammary epithelial cells were obtained by the original organization block adherent method and trypsin digestion method.After treatment with different Chinese herbal extracts for 6 days,the cell proliferation was significantly promoted by extracts ofHerbalycopiandHerbapaederiaeas well as compound perfusion at 10 mg/mL level (P<0.01).Total protein content of cow mammary gland epithelial cells was significantly enhanced by extracts ofHerbalycopi,HerbapaederiaeandFructuschebulaeas well as compound perfusion at 15 mg/mL level (P<0.01).【Conclusion】 Chinese herbal perfusion and extracts at suitable concentrations could promote the growth and protein secretion of cow mammary gland epithelial cells.

cow mammary gland epithelial cells;proliferation;Chinese herbal extract;total protein (TP)

2013-09-22

國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目(2011GB2C300020)

羅 瑩(1990-)，女，安徽滁州人，在讀碩士，主要從事奶牛乳腺細(xì)胞培養(yǎng)以及中藥研究。 E-mail:lyzferik@hotmail.com

吳金節(jié)(1962-)，男，安徽望江人，教授，主要從事動(dòng)物診療技術(shù)及營(yíng)養(yǎng)代謝病研究。E-mail:wjj@ahau.edu.cn

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.027

S853.7

A

1671-9387(2015)01-0014-07

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