張長(zhǎng)慶，劉 婷，趙生國(guó)，雷趙民，王欣榮，孫國(guó)虎，李世歌，李耀東，吳建平

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

脂聯(lián)素基因在荷斯坦公牛不同組織部位的表達(dá)差異

張長(zhǎng)慶，劉 婷，趙生國(guó)，雷趙民，王欣榮，孫國(guó)虎，李世歌，李耀東，吳建平

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

【目的】 研究脂聯(lián)素基因在荷斯坦公牛不同組織及月齡間的相對(duì)表達(dá)差異性，為脂聯(lián)素基因作為荷斯坦公牛育肥指標(biāo)的分子輔助標(biāo)記提供依據(jù)?！痉椒ā?運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了脂聯(lián)素基因在15和17月齡荷斯坦公牛脂肪組織(背部脂肪、腰部脂肪、腎周脂肪、腸系膜脂肪)和肌肉組織(背最長(zhǎng)肌和半腱肌)間的相對(duì)表達(dá)差異性。【結(jié)果】 15月齡時(shí)脂聯(lián)素基因在荷斯坦公牛腎周脂肪和腸系膜脂肪中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于腰部脂肪、背部脂肪、背最長(zhǎng)肌和半腱肌(P<0.01)，17月齡時(shí)僅顯著高于背最長(zhǎng)肌和半腱肌(P<0.05)；17月齡時(shí)該基因在背部脂肪中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于15月齡時(shí)(P<0.05)?！窘Y(jié)論】 脂聯(lián)素基因在15和17月齡荷斯坦公牛脂肪組織和肌肉組織中均有表達(dá)，且在脂肪組織和肌肉組織間具有組織表達(dá)差異性。

脂聯(lián)素基因；荷斯坦公牛；不同組織部位；表達(dá)差異

脂聯(lián)素(adiponectin)是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪細(xì)胞因子，又被稱為 ACRP30、ADIPOQ、APM1或 GBP28。目前，對(duì)小鼠[1]和人[2-3]脂聯(lián)素基因結(jié)構(gòu)及小鼠[4]、雞[5]、鴨[6]和豬[7]等物種的脂聯(lián)素基因的表達(dá)研究認(rèn)為，脂聯(lián)素具有多種生理功能，它參與血脂血糖代謝、炎癥等病理生理過(guò)程，在代謝綜合癥及拮抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面都具有重要作用；在臨床上它與肥胖、胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病及心血管疾病等密切相關(guān)[8-11]。牛脂聯(lián)素基因定位于第1號(hào)染色體上，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，全長(zhǎng)11 779 bp，其中cDNA長(zhǎng)度為720 bp，編碼240個(gè)氨基酸[12]。研究表明脂聯(lián)素參與了牛脂肪代謝的調(diào)節(jié)[13]。叢立新等[14]曾從牛脂肪組織中提取總RNA，成功克隆了牛脂聯(lián)素全基因671 bp cDNA。在對(duì)夏洛萊?！良t安格斯牛和海福特?！羴啿“哺袼古５难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素基因的特異表達(dá)與其背膘厚度具有一定的相關(guān)性[15]。但目前對(duì)牛脂聯(lián)素基因在不同組織部位的表達(dá)研究較少。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，對(duì)荷斯坦公牛不同組織部位脂聯(lián)素基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了研究，為脂聯(lián)素基因作為荷斯坦公牛育肥指標(biāo)的分子輔助標(biāo)記提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取6頭同胎次體質(zhì)量相近的荷斯坦公犢牛，在同一飼養(yǎng)條件下育肥至15 和17月齡時(shí)(育肥條件下，15和17月齡時(shí)荷斯坦公牛平均活體質(zhì)量分別為500和550 kg/頭，達(dá)到適宜出欄的體質(zhì)量)各屠宰3頭，屠宰剝皮后立即采集脂肪組織(背部脂肪、腰部脂肪、腎周脂肪、腸系膜脂肪)和肌肉組織(背最長(zhǎng)肌(12～13肋骨間)和半腱肌)，放入液氮罐中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有樣品均在牛屠宰剝皮?5 min內(nèi)采集，除腸系膜脂肪外，其他組織樣品均采自左半胴體。

1.2 總RNA的提取

參照RNAiso Plus(Total RNA extraction reagent)的RNA提取步驟分別提取牛各組織樣品中的總RNA，每頭牛各組織部位樣品提取1份總RNA，并利用Implen超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(NanoPhotometer)測(cè)定總 RNA 濃度和純度，其完整性以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3 cDNA 的合成

1.3.1 總RNA中少量基因組 DNA污染的去除 基因組DNA去除反應(yīng)的反應(yīng)液需在冰上準(zhǔn)備。反應(yīng)液為：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，總RNA(使加入的總RNA量達(dá)到1 μg)，RNase Free dH2O補(bǔ)齊到10.0 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 2 min；4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 在冰上準(zhǔn)備反應(yīng)液：DNA去除反應(yīng)混合液 10.0 μL，5×PrimeScript Buffer2(for Real Time) 4.0 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，RNase Free dH2O 4.0 μL，合計(jì) 20.0 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后將合成的cDNA稀釋至100 μL，即終質(zhì)量濃度相當(dāng)于 10 ng/μL 總 RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩DNA 的合成反應(yīng)均在普通PCR儀上進(jìn)行。

1.4 引物設(shè)計(jì)與內(nèi)參基因的選擇

根據(jù)脂聯(lián)素基因mRNA序列(GenBank登錄號(hào)NM_004797)，利用Primer3s設(shè)計(jì)脂聯(lián)素基因引物序列， F：5′-GATCCAGGTCTTGTTGGTCCTA-A-3′，R：5′-GAGCGGTATACATAGGCACTTTC-TC-3′，產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度131 bp，退火溫度61.1 ℃。參照Duckett等[16]設(shè)計(jì)的GAPDH引物序列，F(xiàn)：5′-GGGTCATCATCTCTGCACCT-3′，R：5′-GGTCT-AAGTCCCTCCACGA-3′，產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度176 bp，退火溫度59.8 ℃。將GAPDH基因作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因。引物均由賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用 SYBR Premix ExTaqⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR 反應(yīng)體系包括：SYBR Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0 μL，稀釋的cDNA 模板(<100 ng)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，dH2O(滅菌蒸餾水)補(bǔ)齊到20 μL。 PCR反應(yīng)在LightCycler 480 System Real Time PCR擴(kuò)增儀上完成。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s(升溫速率4.4 ℃/s)，1 cycle；95 ℃ 5 s (升溫速率4.4 ℃/s)，60 ℃ 30 s (升溫速率2.2 ℃/s，Acquisition Mode:Single)，40 cycles；95 ℃ 5 s (升溫速率4.4 ℃/s) ，60 ℃ 1 min (升溫速率2.2 ℃/s)，95 ℃ 0 s(升溫速率0.11 ℃/s,Acquisition Mode:Continuous,Acquisitions:5/℃)，1 cycle； 50 ℃ 30 s (升溫速率2.2 ℃/s) ，1 cycle 。每個(gè)樣品重復(fù)3次。每對(duì)引物分別設(shè)立3個(gè)內(nèi)參基因不含模板的陰性對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)脂聯(lián)素基因在荷斯坦公牛同月齡不同組織部位及不同月齡同一組織部位的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法和Duncans法對(duì)各部位的相對(duì)表達(dá)差異性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果均表示為“平均值±SD”。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛RNA提取結(jié)果檢測(cè)

RNA 提取結(jié)果是決定實(shí)時(shí)熒光定量PCR 成敗的關(guān)鍵。電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，荷斯坦公牛各組織部位樣品的RNA均可見(jiàn)清晰的2條帶(28S rRNA、18S rRNA)，其條帶亮度比值均大于3∶1，表明提取的總RNA未出現(xiàn)降解。用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)定量，OD260/OD280值均在1.82～2.04，說(shuō)明提取的總RNA純度較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

2.2 牛脂聯(lián)素基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

以荷斯坦公牛不同組織部位的總RNA為模板，以設(shè)計(jì)的引物分別對(duì)脂聯(lián)素基因和GAPDH基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別獲得大小約131和176 bp的條帶(圖2)，與預(yù)期目的片段和內(nèi)參基因片段大小基本相符。

2.3 脂聯(lián)素基因在牛組織間的相對(duì)表達(dá)

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)荷斯坦公牛背部脂肪、腰部脂肪、腎周脂肪、腸系膜脂肪、背最長(zhǎng)肌、半腱肌等6個(gè)脂肪和肌肉組織部位中脂聯(lián)素基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，脂聯(lián)素基因在15和17月齡荷斯坦公牛的不同組織部位均存在不同程度的表達(dá)。在15月齡荷斯坦公牛不同脂肪和肌肉組織中，其相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為：腎周脂肪、腸系膜脂肪、腰部脂肪、背部脂肪、背最長(zhǎng)肌、半腱肌，且腎周脂肪和腸系膜脂肪相對(duì)表達(dá)量極顯著高于背部脂肪、腰部脂肪、背最長(zhǎng)肌和半腱肌(P<0.01)；而在17月齡荷斯坦公牛不同脂肪和肌肉組織中，其相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為：腸系膜脂肪、腎周脂肪、背部脂肪、腰部脂肪、背最長(zhǎng)肌、半腱肌，且腸系膜脂肪和腎周脂肪相對(duì)表達(dá)量顯著高于背最長(zhǎng)肌和半腱肌(P<0.05)。對(duì)于同一組織部位，脂聯(lián)素基因的相對(duì)表達(dá)量隨著年齡變化而不同，在背部脂肪中該基因的相對(duì)表達(dá)量17月齡顯著高于15月齡(P<0.05)。

注：同列不同大寫(xiě)字母表示同月齡不同組織部位差異極顯著(P<0.01)，不同小寫(xiě)字母表示同月齡不同組織部位差異顯著(P<0.05)；“*”表示同一組織部位不同月齡差異顯著(P<0.05)。

Note:Different uppercase and lowercase letters indicate highly significant difference (P<0.01) and significant difference(P<0.05) among different tissues at each age,respectively;“*” shows significant difference (P<0.05) between different ages in each tissue.

3 討 論

脂聯(lián)素是脂肪組織基因表達(dá)最豐富的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之一，受到激素水平的調(diào)控，可以調(diào)節(jié)脂肪代謝，是機(jī)體脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子[17-18]，它以內(nèi)分泌方式循環(huán)于血液中，參與調(diào)節(jié)葡萄糖、脂肪酸代謝及抵抗炎癥反應(yīng)等生命活動(dòng)[19]。近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素及脂聯(lián)素基因與人類代謝綜合癥、肥胖綜合癥、動(dòng)脈粥樣硬化、Ⅱ型糖尿病、胰島素抵抗等許多疾病有著較為密切的關(guān)系[8-11]。

研究表明脂聯(lián)素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)與肥胖呈負(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子[20]，肥胖癥患者血漿脂聯(lián)素水平較正常人有所下降，提示脂聯(lián)素參與了脂肪代謝的調(diào)節(jié)[14]。張輝等[21]通過(guò)對(duì)荷斯坦新生犢牛前脂肪細(xì)胞體外單層貼壁培養(yǎng)的研究表明，脂聯(lián)素基因在荷斯坦?fàn)倥Ｇ爸炯?xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)期均有不同程度的表達(dá)，而且隨著前脂肪細(xì)胞分化成熟脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的逐漸蓄積，脂聯(lián)素基因 mRNA 水平也逐漸升高，到第 12天時(shí)表達(dá)最高，說(shuō)明脂聯(lián)素基因的表達(dá)可能與脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)積聚有著密切的關(guān)系。張輝等[22]研究發(fā)現(xiàn)，延邊黃牛脂肪組織脂聯(lián)素基因 mRNA 水平與肌肉脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.001)，驗(yàn)證了之前的研究結(jié)果，二者一致表明脂聯(lián)素基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化及影響肌內(nèi)脂肪含量而影響胴體性狀。研究證明脂肪細(xì)胞是誘導(dǎo)脂聯(lián)素基因表達(dá)的必須組織[23]，小鼠和大鼠的脂聯(lián)素基因高度特異地表達(dá)于脂肪組織。Wang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，豬脂聯(lián)素基因在脂肪組織細(xì)胞中表達(dá)豐富；Dai等[25]半定量RT-PCR研究表明，豬脂聯(lián)素基因mRNA特異表達(dá)于脂肪組織；Maddineni等[26]、Yuan等[5]研究表明，雞脂聯(lián)素基因在脂肪組織中表達(dá)量最高；薛茂云等[6]對(duì)鴨脂聯(lián)素基因在不同組織中表達(dá)差異的研究顯示，該基因在脂肪組織的表達(dá)最高。本研究結(jié)果顯示，脂聯(lián)素基因在同月齡荷斯坦公牛的不同組織部位均有不同程度的表達(dá)，15月齡時(shí)，脂聯(lián)素基因的相對(duì)表達(dá)在腎周脂肪組織最高，而在半腱肌極低，總體來(lái)看該基因在腎周脂肪組織和腸系膜脂肪組織的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他組織部位(P<0.01)；17月齡時(shí)，脂聯(lián)素基因的相對(duì)表達(dá)量在腸系膜脂肪組織最高，而在半腱肌依然很低，顯然該基因在半腱肌和背最長(zhǎng)肌的相對(duì)表達(dá)量顯著低于其他脂肪組織部位(P<0.05)。這一結(jié)果與上述諸多研究結(jié)果一致，由此推斷脂聯(lián)素基因在荷斯坦公牛脂肪組織中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于肌肉組織。

有研究表明，在飼喂同一能量水平日糧時(shí)，延邊黃牛脂肪組織脂聯(lián)素基因mRNA水平有隨著育肥日齡增加而增加的趨勢(shì)[22]。而本研究結(jié)果顯示，在17月齡時(shí)荷斯坦公牛背部脂肪組織、腰部脂肪組織、腸系膜脂肪組織和半腱肌脂聯(lián)素基因的相對(duì)表達(dá)量較15月齡均有升高，且在背部脂肪組織17月齡顯著高于15月齡(P<0.05)，這與上述研究結(jié)果一致，但在腎周脂肪組織和背最長(zhǎng)肌17月齡低于15月齡，與上述研究結(jié)果有差異。在人[18]和小鼠[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)脂肪過(guò)度沉積時(shí)，脂肪組織中脂聯(lián)素基因的表達(dá)量降低；肉牛皮下脂肪的生長(zhǎng)發(fā)育與脂聯(lián)素基因的表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性[15]，而且在牛體軀脂肪組織生長(zhǎng)中腎周脂肪與腹腔和盆腔脂肪的生長(zhǎng)先于肌肉間脂肪、皮下脂肪和肌肉內(nèi)脂肪[28]，由此斷定17月齡時(shí)腎周脂肪可能已大量沉積，也進(jìn)一步說(shuō)明脂聯(lián)素在調(diào)節(jié)脂肪沉積過(guò)程中具有一定作用。

曾有研究者將脂聯(lián)素基因作為豬脂肪沉積的候選基因，對(duì)其進(jìn)行多態(tài)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素基因的多態(tài)性與豬脂肪沉積及胴體性狀相關(guān)[25,29]。研究還發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素基因的基因型與波爾山羊的生長(zhǎng)性狀具有一定相關(guān)性[30]。Morsci等[31]研究證實(shí)，在安格斯牛脂聯(lián)素基因座(位于安格斯牛BTA1上)附近的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)影響著牛肉的大理石紋、眼肌面積和脂肪厚度。本研究中，脂聯(lián)素基因在所檢測(cè)的組織部位均有不同程度的表達(dá)，從15月齡到17月齡，脂聯(lián)素基因的相對(duì)表達(dá)量在背最長(zhǎng)肌和腎周脂肪組織下降，而在其他組織部位上升，且在背部脂肪組織17月齡顯著高于15月齡(P<0.05)。這些變化必然與各組織部位脂聯(lián)素水平的變化有著密切的關(guān)系，脂聯(lián)素又是脂肪細(xì)胞所分泌的一種蛋白因子，所以這些變化也在不同程度上反映了荷斯坦公牛在育肥過(guò)程中體軀脂肪的生長(zhǎng)發(fā)育變化。

楊彥杰等[12]研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素基因與秦川牛胸圍、眼肌面積、背膘厚、胴體腿臀圍等育肥指標(biāo)密切相關(guān)，推斷該基因可以作為影響秦川牛產(chǎn)肉性狀的候選基因而用于秦川牛新品系的輔助選擇。Shin等[32]研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性對(duì)朝鮮牛的背膘厚度和眼肌面積有顯著影響，由此推斷該基因可作為朝鮮牛胴體性狀選擇的有效分子標(biāo)記。作為唯一隨脂肪含量的增加而表達(dá)下降的脂肪因子，脂聯(lián)素在脂肪生長(zhǎng)發(fā)育及代謝中的作用還有待于更深入的研究，脂聯(lián)素基因也將有望成為影響肉牛胴體性狀的分子標(biāo)記并在肉牛育肥選育中發(fā)揮重要作用。

本研究只是初步探討了脂聯(lián)素基因在荷斯坦公牛不同月齡、不同組織的表達(dá)差異性規(guī)律，本課題組還將對(duì)血液生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)荷斯坦牛肌肉和脂肪組織的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行分析，進(jìn)一步探討脂聯(lián)素基因在牛肌肉和脂肪生長(zhǎng)發(fā)育及代謝中的作用機(jī)制，并對(duì)該基因?qū)εｋ伢w性狀的影響進(jìn)行總結(jié)，以期推廣應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

4 結(jié) 論

(1)脂聯(lián)素基因在15和17月齡荷斯坦公牛的脂肪組織(背部脂肪、腰部脂肪、腸系膜脂肪、腎周脂肪)和肌肉組織(背最長(zhǎng)肌、半腱肌)均有不同程度的表達(dá)，且脂肪組織與肌肉組織間具有表達(dá)差異性。

(2)在同一組織部位脂聯(lián)素基因的相對(duì)表達(dá)量隨著月齡變化而不同，尤其在背部脂肪組織差異最大。

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Expression differences ofADIPOQgene in different tissues of Holstein bull

ZHANG Chang-qing,LIU Ting,ZHAO Sheng-guo,LEI Zhao-min,WANG Xin-rong,SUN Guo-hu,LI Shi-ge,LI Yao-dong,WU Jian-ping

(FacultyofAnimalSci-Tech,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu730070,China)

【Objective】 The objective of this study was to compare the expressions of adiponectin (ADIPOQ) gene in different tissues of Holstein bulls at different ages.【Method】 Real-time fluorescent quantitative PCR was used to determine the relative expression ofADIPOQgene using RNA isolated from different adipose tissues (subcutaneous fat over sirloin,subcutaneous fat over rib,kidney fat,and mesenteric fat) and muscle tissues (longissimus dorsi and semitendinosus) of Holstein bulls with two different ages (15 and 17 months).【Result】 Expressions ofADIPOQin kidney fat and mesenteric fat were greater (P<0.01) than in subcutaneous sirloin fat,subcutaneous rib fat,longissimus dorsi and semitendinosus in 15 month group and greater(P<0.05)than in longissimus dorsi and semitendinosus in 17 month group.Expressions ofADIPOQgene also differed between 15 month and 17 month old Holstein bulls in the same adipose tissues.The expressions in subcutaneous rib fat in 17 month group were greater (P<0.05) than in 15 month group.【Conclusion】 Expressions ofADIPOQgene in different tissues of Holstein bulls with ages of 15 month and 17 month differed.These results suggested that evaluation of expressions ofADIPOQgene should consider the age as well as the tissue.

ADIPOQgene;Holstein bulls;different tissues;differential expression

2013-09-29

蘭州市科技局農(nóng)業(yè)科技專項(xiàng)(2011-1-10)；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2010-04，GNSW-2011-27)

張長(zhǎng)慶(1986-)，男，甘肅武威人，在讀碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖學(xué)研究。E-mail：836025862@qq.com

吳建平(1960-)，男，甘肅定西人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物遺傳育種、家畜生產(chǎn)體系研究。 E-mail:wujp@gsau.edu.cn

時(shí)間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.030

S823.2

A

1671-9387(2015)01-0031-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.030.html