袁　凱，梁　德，吳雪瓊，姚珍松，晉大祥，楊志東，張順聰，丁金勇，江曉兵，陳建庭

1廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510405

2中國人民解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所全軍結(jié)核病防治重點實驗室，北京 100091

3南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510515

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以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫斑點技術在脊柱結(jié)核感染輔助診斷中的應用價值

袁凱1，梁德1，吳雪瓊2，姚珍松1，晉大祥1，楊志東1，張順聰1，丁金勇1，江曉兵1，陳建庭3

1廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510405

2中國人民解放軍第309醫(yī)院全軍結(jié)核病研究所全軍結(jié)核病防治重點實驗室，北京 100091

3南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科，廣州 510515

摘要：目的評價以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)技術在脊柱結(jié)核感染輔助診斷中的應用價值。方法選取2012年5月至2013年12月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科和南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科收治的疑似脊柱結(jié)核患者91例，根據(jù)臨床和細菌性診斷結(jié)果分為脊柱結(jié)核組(n=52)和對照組(n=39)。采用ELISPOT試驗檢測脊柱結(jié)核組和對照組外周血單個核細胞，觀察斑點形成細胞的數(shù)量?；颊咄瑫r接受結(jié)核菌素(PPD)皮膚試驗、血清抗結(jié)核抗體檢測、病灶病理學檢查、抗酸桿菌涂片和病灶結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，比較不同檢測方法的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值，分析不同檢測結(jié)果的一致性。結(jié)果52例脊柱結(jié)核患者中共47例接受病灶活檢穿刺病理檢查，其中41例病理證實為結(jié)核。ELISPOT試驗在脊柱結(jié)核診斷中的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為82.7%、87.2%、89.6%和79.1%；PPD皮膚試驗的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為61.5%、46.2%、60.4%和47.4%；血清抗結(jié)核抗體試驗的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為55.8%、61.5%、65.9%和51.1%。在脊柱結(jié)核患者中，ELISPOT試驗的陽性率顯著高于PPD皮膚試驗(82.7%比61.5%，χ2=5.786，P=0.016)和血清抗結(jié)核抗體試驗(82.7%比55.8%，χ2=8.847，P=0.003)，與病理學檢查比較差異無統(tǒng)計學意義(82.7%比87.2%，χ2=0.396，P=0.529)。ELISPOT試驗與病理學檢查一致性較好(87.2%，κ=0.498，P=0.001)。結(jié)論以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT法應用于脊柱結(jié)核診斷有良好的敏感性和特異性，可作為脊柱結(jié)核感染輔助診斷的有效方法。

關鍵詞：脊柱結(jié)核；酶聯(lián)免疫斑點試驗；CFP10/ESAT6融合蛋白；輔助診斷

Diagnostic Value of Enzyme-linked Immunospot Assay Using CFP10/ESAT6 Fusion Protein as Antigen in Spinal Tuberculosis

YUAN Kai1，LIANG De1，WU Xue-qiong2，YAO Zhen-song1，JIN Da-xiang1，YANG Zhi-dong1，ZHANG Shun-cong1，DING Jin-yong1，JIANG Xiao-bing1，CHEN Jian-ting3

1Department of Spine Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of

ActaAcadMedSin，2015,37(1)：44-49

脊柱結(jié)核是最常見的骨關節(jié)結(jié)核，約占骨結(jié)核的50%，占所有結(jié)核的1%~3%[1]。脊柱結(jié)核發(fā)病隱匿，進展遲緩，癥狀體征不明顯，因此早期診斷非常困難。傳統(tǒng)的結(jié)核病檢測方法(結(jié)核菌素試驗、涂片染色鏡檢、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和分子生物學方法)檢出率明顯低于肺內(nèi)結(jié)核，嚴重影響患者的預后，致殘率高。

酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzyme-linked immunespot，ELISPOT)是根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗原理建立的一種體外檢測單細胞水平特異性抗體分泌細胞功能的免疫學技術。目前的T-SPOT.TB試劑盒(英國Oxford Immunotec公司)是采用結(jié)核分枝桿菌特異的早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretory antigentic target 6kDa protein，ESAT- 6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(culture filtrate protein 10，CFP10)多肽刺激結(jié)核致敏T淋巴細胞分泌干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，并應用ELISPOT檢測分泌IFN-γ的T淋巴細胞[2]。近年來，采用ELISPOT 技術定量檢測外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)對結(jié)核分枝桿菌抗原的特異性釋放反應開始被廣泛用于肺外結(jié)核感染的診斷[3]，但將其單純應用于脊柱結(jié)核感染診斷的研究較少。本研究初步探討以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT技術用于輔助診斷脊柱結(jié)核感染的應用價值。

對象和方法

對象選取2012年5月至2013年12月廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院脊柱骨科和南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科收治的疑似脊柱結(jié)核患者91例。自行設計患者信息采集表，收集基本臨床信息和臨床結(jié)果，并對受試者出院進一步隨訪。根據(jù)患者最終的臨床診斷和細菌學診斷結(jié)果，由不知曉ELISPOT結(jié)果的主治醫(yī)師將入選患者按照以下標準分為脊柱結(jié)核組(n=52)和對照組(n=39)。

脊柱結(jié)核組入選標準為：(1)患者影像學具備脊柱結(jié)核特征；(2)術前或術中活檢病灶標本培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，或者病灶組織標本病理檢查符合結(jié)核改變；(3)菌種鑒定排除非結(jié)核分枝桿菌感染；(4)脊柱結(jié)核患者抗結(jié)核治療少于2周；(5)排除HIV感染。該組包括男31例，女21例，平均年齡(42.3±18.4)歲(2~86歲)；合并高血壓3例，乙肝5例，梅毒2例，強直性脊柱炎1例，類風濕性關節(jié)炎2例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡2例，肝硬化1例，肺結(jié)核7例；參考Jung等[4]的診斷標準，有10例脊柱結(jié)核患者合并免疫功能缺陷。

對照組入選標準為：(1)非脊柱結(jié)核疾病住院患者；(2)與脊柱結(jié)核組無血緣關系；(3)排除結(jié)核分枝桿菌感染；(4)影像學檢查無結(jié)核表現(xiàn)；(5)無結(jié)核患者接觸史；(6)排除HIV感染。該組包括男17例，女22例，平均年齡(46.5±13.9)歲(18~69歲)；其中確診為腰椎間盤突出癥16例，頸椎病6例，脊柱轉(zhuǎn)移瘤5例，脊柱椎管內(nèi)腫瘤8例，化膿性脊柱炎4例；脊柱轉(zhuǎn)移瘤患者中有2例合并免疫功能缺陷[4]。

本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有入選患者均簽署知情同意書。

主要儀器及設備酶聯(lián)斑點分析儀為美國Cellular Techology Ltd.公司產(chǎn)品，由中國人民解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究所免費進行檢測；96孔細胞培養(yǎng)板為美國MILIPOR公司產(chǎn)品。CFP10/ESAT6融合蛋白由中國人民解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究所提供[5]；結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)購自廣州龍成藥業(yè)有限公司；鏈親和素-堿性磷酸酶、5-溴- 4-氯- 3-吲哚磷酸鹽(5-bromo- 4-chloro- 3-indolyl phosphate，BCIP)和硝基藍四氮唑(nitro blue tetrazolium，NBT)底物、人IFN-γ捕獲抗體和人IFN-γ檢測抗體購自瑞士Mabtech AB公司；植物血凝素購自美國Sigma公司；淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque PLUS)購自美國GE公司；人抗結(jié)核桿菌酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海奧普生物醫(yī)藥有限公司；羅氏培養(yǎng)管購自河南美凱生物有限公司。

ELISPOT試驗包被微孔板上每孔加入100 μl稀釋IFN-γ捕獲單克隆抗體，4 ℃冰箱過夜。每位患者采集3~4 ml外周血，用淋巴細胞分層液分離(23 ℃，2500 r/min，離心20 min)、提純PBMC，調(diào)節(jié)細胞濃度至2.5×106/L。

每個樣本使用3個孔檢測分泌IFN-γ的T細胞：在陰性對照孔內(nèi)加入完全細胞培養(yǎng)液50 μl，在陽性對照孔內(nèi)加入陽性對照植物血凝素50 μl，在檢測孔內(nèi)加入CFP10/ESAT6融合蛋白50 μl。在3個孔內(nèi)加入100 μl含2.5×105個PBMC的懸液，將微孔板置于37 ℃含5%CO2的孵箱中孵育20 h。棄上清液，裂解細胞后，用200 μl 1×PBS洗板7次，每次l min。每孔加入100 μl的檢測抗體，37 ℃孵育1 h。洗板后，每孔加入100 μl鏈親和素-堿性磷酸酶，室溫孵育30 min。洗板后，每孔加入100 μl新鮮配制的BICP/NBT底物。顯色15 min，可見板底顯示紫色斑點，用滅菌水洗板終止反應。每1個點代表1個分泌IFN-γ的T細胞，采用酶聯(lián)斑點分析儀計數(shù)著色的斑點。

結(jié)果判斷標準：陰性對照孔和陽性對照孔起質(zhì)量控制作用。根據(jù)前期實驗受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線確定的陽性閾值[6]，陽性結(jié)果的標準為：(1)空白對照孔斑點數(shù)<17時，檢測孔斑點數(shù)-空白對照孔斑點數(shù)≥17；(2)空白對照孔斑點數(shù)≥17時，檢測孔斑點數(shù)≥空白對照孔斑點數(shù)×2。如果不符合上述標準且陽性對照孔正常(陽性對照孔斑點數(shù)應>20個或遍布整個反應孔)，檢測結(jié)果為陰性(圖1)。

ELISPOT試驗的標準化與質(zhì)量控制由于ELISPOT試驗的敏感性很高[6]，斑點形成容易受到諸多因素影響。本課題組前期的相關研究已建立了一套標準化的實驗操作規(guī)范[6]。該項檢測由1名經(jīng)過嚴格ELISPOT檢測培訓的人員完成，并且檢測過程中確保了實驗設備、試劑、耗材的選擇標準化。

抗酸桿菌涂片及抗結(jié)核抗體檢測將術前穿刺和術中收集的膿液標本經(jīng)離心沉淀，少量生理鹽水混勻沉淀物，均勻涂抹于載玻片上，自然干燥后行抗酸染色鏡檢。采用人抗結(jié)核桿菌酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測抗結(jié)核抗體。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)將術前穿刺和術中收集的膿液標本經(jīng)消化處理，接種于羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)4~8周，每周觀察1次，記錄培養(yǎng)結(jié)果。

PPD皮膚試驗在抽完靜脈血(ELISPOT使用)后，吸取0.1 ml PPD稀釋液(含5 U PPD)注射于前臂掌側(cè)皮內(nèi)。于注射后72 h檢查注射部位反應，硬結(jié)的橫徑及縱徑的平均數(shù)≥5 mm為陽性。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，以敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值來評價各種檢測方法；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，兩兩樣本率的比較采用χ2分割法；不同檢測方法間一致性比較采用Kappa一致性相關分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

標本獲取及檢測情況入選的91例患者均接受了ELISPOT、PPD皮膚試驗和血清抗結(jié)核抗體檢測。脊柱結(jié)核組中有47例接受了活檢穿刺病理檢測，42例行抗酸桿菌涂片檢查，40例行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)(表1)。

ELISPOT試驗與臨床常用診斷方法比較脊柱結(jié)核組中病灶抗酸桿菌涂片和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率分別為35.7%和57.5%。本研究91例患者中，ELISPOT試驗呈陽性結(jié)果的有48例(圖1)。PPD皮膚試驗的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為61.5%、46.2%、60.4%和47.4%；血清抗結(jié)核抗體試驗的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為55.8%、61.5%、65.9%和51.1%；ELISPOT試驗的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值分別為82.7%、87.2%、89.6%和79.1%。在脊柱結(jié)核組中，ELISPOT試驗的總體陽性率顯著高于PPD皮膚試驗(P=0.016)和血清抗結(jié)核抗體試驗(P=0.003)(表1)。經(jīng)配對χ2檢驗，脊柱結(jié)核組中ELISPOT試驗結(jié)果與PPD皮膚試驗(P=0.013)和血清抗結(jié)核抗體試驗(P=0.003)結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學意義，與病理學檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.688)(表2)。對脊柱結(jié)核組患者中ELISPOT試驗結(jié)果與PPD皮膚試驗、抗結(jié)核抗體試驗和病理學檢查結(jié)果進行一致相關性分析的結(jié)果顯示，病理學檢查與ELISPOT試驗結(jié)果一致性較好(87.2%，κ=0.498，P=0.001，表3)。

討論

目前脊柱結(jié)核的診斷主要依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、影像學檢查及病灶的病理改變。細菌學檢查是脊柱結(jié)核確診的重要方法，但其培養(yǎng)技術仍然滯后，陽性率較低，現(xiàn)行的實驗室病原學檢測及菌種鑒定方法遠不能滿足臨床輔助診斷的需求[7]。本研究中脊柱結(jié)核組患者病灶結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的陽性率僅為57.5%。免疫學檢查的價值雖然不如細菌學檢查，但較為簡便、快速，又有一定的敏感性和特異性，不失為輔助診斷結(jié)核病的有效方法，尤其適用于肺外結(jié)核患者[8]。

近年來發(fā)展起來的ELISPOT技術是一種新型的免疫酶技術，為早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病提供了新的方向[9- 10]。在結(jié)核性胸膜炎、皮膚結(jié)核、骨結(jié)核等肺外結(jié)核的輔助診斷中，ELISPOT顯示了良好的敏感性和特異性[11- 14]。Hill等[15]研究表明，以CFP10/ESAT6融合蛋白刺激T淋巴細胞可取得同樣的檢測效果。本課題組前期研究證實，以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT技術在肺結(jié)核中有良好的診斷效果[16]。劉菲等[17]研究結(jié)果表明，ESAT6/CFP10-ELISPOT可作為輔助診斷初治肺結(jié)核的較為準確的方法。本研究也顯示了以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISOPT技術在脊柱結(jié)核輔助診斷中的應用價值，而且通過基因工程大量制備重組蛋白的費用低于多肽合成，故本方法可以明顯降低檢測費用。

本研究中，ELISPOT技術在脊柱結(jié)核患者中的診斷陽性率為82.7%，顯著高于PPD皮膚試驗的61.5%和血清抗結(jié)核抗體試驗的55.8%。Lai 等[13]采用T-SPOT.TB試劑盒檢測骨結(jié)核的陽性率為86.7%(其中9例脊柱結(jié)核的陽性率為100%)，但該試劑盒的特異性為61.9%，本研究所采用ELISOPT的特異性為87.2%。脊柱結(jié)核組52例患者中有47例接受了病灶組織活檢，其中經(jīng)病理確診的41例患者中有37例ELISPOT結(jié)果呈陽性；病灶結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性的23例患者ELISPOT結(jié)果均為陽性。在脊柱結(jié)核患者中，ELISPOT試驗的陽性率與病理學結(jié)果的陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義，且一致性較好。上述結(jié)果提示，CFP10/ESAT6-ELISPOT技術可為脊柱結(jié)核感染患者提供有效的輔助診斷依據(jù)，特別是在患者病灶無法獲得、暫無細菌學結(jié)果時。

表 1　脊柱結(jié)核組中ELISPOT試驗與臨床常用結(jié)核診斷方法的比較(n=52)

ELISPOT：酶聯(lián)免疫斑點；PPD：結(jié)核菌素純蛋白衍生物；與ELISPOT比較，aP=0.016，bP=0.003

ELISPOT：enzyme-linked immunospot；PPD：tuberculin purified protein derivative；aP=0.016，bP=0.003 compared with ELISPOT

A.對照組(非脊柱結(jié)核疾病)ELISPOT結(jié)果陰性；B.脊柱結(jié)核組ELISPOT結(jié)果陽性

A. negative result of ELISPOT assay in a patient in the control group(non-spinal tuberculosis)；B. positive result of ELISPOT assay in a patient in the spinal tuberculosis group

圖 1ELISPOT檢測外周血中分泌干擾素-γ的淋巴細胞的代表性結(jié)果

Fig 1Representative results of ELISPOT assay detecting interferon-γ-secreting lymphocytes in peripheral blood

表 2　脊柱結(jié)核組ELISPOT檢測與PPD皮膚試驗、抗結(jié)核抗體試驗和病理學檢查的配對比較(n)

表 3　脊柱結(jié)核組中ELISPOT試驗與PPD皮膚試驗、抗結(jié)核抗體試驗和病理學檢查的一致性分析

本研究也存在一些不足。在入選的52例脊柱結(jié)核患者中，有10例合并免疫功能缺陷，其中僅1例PPD皮膚試驗呈陽性，5例ELISPOT結(jié)果呈陽性。PPD皮膚試驗結(jié)果在很大程度上受患者免疫功能的影響，合并免疫功能缺陷的結(jié)核患者PPD陽性率較低[4]，因此本研究中PPD陽性率偏低。由于這部分病例較少，筆者沒有分亞組討論ELISPOT技術在脊柱結(jié)核合并免疫功能缺陷患者中的診斷應用價值，可作為下一步研究的方向。同時，本研究組計劃進一步通過多中心、大樣本研究，驗證ELISPOT技術在脊柱結(jié)核感染診斷中的應用價值。綜上，以CFP10/ESAT6融合蛋白為抗原的ELISPOT技術檢測脊柱結(jié)核感染有良好的敏感性和特異性，可考慮作為脊柱結(jié)核感染的重要輔助診斷方法。

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·論著·

Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China

2Army Tuberculosis Key Laboratory，Institute for Tuberculosis Research，the 309th

Hospital of PLA，Beijing 100091，China

3Department of Spine Orthopedics，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China

Corresponding author：LIANG DeTel：020- 36591604，E-mail：liangde99@sina.com

ABSTRACT：ObjectiveTo establish a method of detecting spinal tuberculosis(TB)infection by enzyme-linked immunospot(ELlSPOT)assay and evaluate the value of CFP10/ESAT6 fusion protein for diagnosis of spinal TB.MethodsSuspected spinal TB patients were prospectively recruited in two hospitals(First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine；Nanfang Hospital，Southern Medical University)from May 2012 to December 2013. Data on clinical characteristics of the patients and conventional laboratory results were collected. Compare and analyze the positive detection rate in spinal TB diagnosis by different methods including ELISPOT detection and conventional detection methods. Results47 patients with spinal TB had available biopsy or surgical specimens for histopathological examination and 41 specimens had pathological features consistent with a diagnosis of TB infection. Among the spinal TB patients and non-TB disease patients，the overall sensitivity，specificity，positive predictive value，and negative predictive value of the ELISPOT assay in spinal TB diagnosis were 82.7%，87.2%，89.6%，and 79.1%，respectively；the 4 indexes of the PPD skin test were 61.5%，46.2%，60.4%，and 47.4%，respectively；those of the antibody detection were 55.8%，61.5%，65.9%，and 51.1%. The positive rate of ELISPOT was significantly higher than those of PPD skin test and antibody detection test(82.7% vs. 61.5%，χ2=5.786，P=0.016；82.7% vs. 55.8%，χ2=8.847，P=0.003)，but not significantly different from the positive rate of pathological examination(82.7% vs. 87.2%，χ2=0.396，P=0.529). Moderate agreement was found between pathological examination and the ELISPOT assay(87.2%，κ=0.498，P=0.001). ConclusionWith high sensitivity and specificity，the ELISPOT assay using CFP10/ESAT6 fusion protein as antigen is an effective technique for auxiliary diagnosis of spinal TB.

Key words：spinal tuberculosis；enzyme-linked immunospot assay；CFP10/ESAT6 fusion protein；auxiliary diagnosis

收稿日期：(2014- 05- 12)

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2015.01.008

中圖分類號:R529.2

文獻標志碼:A

文章編號：1000- 503X(2015)01- 0044- 06

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