劉文慧，吳敏，沈其，徐迎春，陳樞青*

（1.浙江大學(xué)藥學(xué)院生化藥學(xué)研究室，浙江 杭州 310058；2.浙江海正藥業(yè)有限公司，浙江 臺州318000；3.休斯頓醫(yī)學(xué)研究所，休斯頓，77030）

人血清白蛋白融合技術(shù)研究進(jìn)展

劉文慧1，吳敏2，沈其3，徐迎春1，陳樞青1*

（1.浙江大學(xué)藥學(xué)院生化藥學(xué)研究室，浙江 杭州 310058；2.浙江海正藥業(yè)有限公司，浙江 臺州318000；3.休斯頓醫(yī)學(xué)研究所，休斯頓，77030）

結(jié)合筆者所在課題組的實驗研究成果，綜述人血清白蛋白融合技術(shù)研究進(jìn)展。人血清白蛋白融合技術(shù)是近些年來應(yīng)用較多的用于改造小分子蛋白和多肽藥物的手段。但是眾多的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)將小分子蛋白/多肽和人血清白蛋白融合后會出現(xiàn)一些共性的問題，例如目標(biāo)蛋白產(chǎn)率低、易降解等。這些共性問題可以通過融合蛋白的優(yōu)化設(shè)計、蛋白酶缺陷宿主的構(gòu)建、融合基因多拷貝以及與分子伴侶共表達(dá)得以解決。

人血清白蛋白融合技術(shù)；共性問題；優(yōu)化設(shè)計；蛋白酶缺陷宿主；多拷貝；分子伴侶

接受日期：2015-02-03

*通訊作者：陳樞青，教授；

研究方向：微生物與生化藥學(xué)；

Tel：0571-88208411； E-mail：chenshuqing@zju.edu.cn

目前臨床上使用的一些蛋白和多肽類藥物，如胰島素、干擾素、細(xì)胞因子等，具有療效高、副作用少、免疫原性低等優(yōu)點，但是由于其相對分子質(zhì)量較小，易被腎臟快速清除，在人體內(nèi)的半衰期較短，臨床使用時為了維持藥效需要頻繁給藥，進(jìn)而極大地限制了這類藥物在臨床上的應(yīng)用，因此對這類藥物進(jìn)行以延長藥效為目的的改造已迫在眉睫。目前比較常用的對這類藥物進(jìn)行的長效改造策略主要包括：構(gòu)建蛋白突變體、制備緩釋制劑以及與相對分子質(zhì)量較大的藥物載體[如聚乙二醇（PEG）、人血清白蛋白（HSA）、抗體Fc片段等]相連。近年來，利用HSA改善小分子藥物藥代動力學(xué)性質(zhì)的相關(guān)技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。

HSA融合技術(shù)的基本原理是運用PCR技術(shù)將HSA基因和目的基因進(jìn)行基因融合，再轉(zhuǎn)染到真核表達(dá)系統(tǒng)（如酵母）中進(jìn)行表達(dá)。HSA是人體內(nèi)源性蛋白，具有諸多優(yōu)勢，例如能結(jié)合和運輸大量內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，無明顯毒性和免疫原性，體內(nèi)半衰期長達(dá)19 d，因此是改造修飾小分子藥物的理想載體。目前處于臨床研究階段的HSA融合蛋白主要有用于治療慢性丙型肝炎的HSA/α干擾素（IFN-α）、治療嗜中性粒細(xì)胞減少癥的HSA/粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、治療充血性心衰的HSA/腦鈉肽（BNP）等。2014年美國FDA批準(zhǔn)了首個HSA融合蛋白藥物阿必魯泰（albiglutide，Tanzeum），其為二肽基肽酶Ⅳ（DPPIV）耐受的胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和重組HSA的融合蛋白，是一種用于治療2型糖尿病的長效生物藥物[3]，其成功上市為諸多HSA融合蛋白藥物的上市帶來了希望和動力。小分子蛋白/多肽藥物和HSA融合后雖然能夠顯著延長藥物的半衰期，但是在一些研究中發(fā)現(xiàn)HSA融合蛋白在表達(dá)過程中會出現(xiàn)一些共性的問題，如融合蛋白的體外生物學(xué)活性有著不同程度的降低、表達(dá)產(chǎn)物不均一、易降解、表達(dá)水平低等。這些共性問題與HSA及目的蛋白的性質(zhì)、融合方式以及融合蛋白的糖基化水平、表達(dá)載體和表達(dá)宿主的選擇等緊密相關(guān)。

白介素1受體拮抗劑（IL1Rα）是特異性的天然拮抗劑分子，臨床上主要用于中度及重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，近些年來的一些動物實驗以及臨床試驗研究表明其對2型糖尿病有著顯著的治療效果；人生長激素（hGH）是人體內(nèi)重要的多功能激素，具有促進(jìn)生長和蛋白質(zhì)合成以及影響脂肪與糖代謝的功能，臨床上主要用于成人和兒童生長激素缺乏癥、Turner綜合征等；人甲狀旁腺激素1-34（PTH1-34）是人體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝的重要因子，具有抗骨重吸收和促骨重吸收的雙重作用，臨床上主要用于骨質(zhì)疏松癥的治療。這3種藥物均由于分子質(zhì)量小、半衰期短，從而使其在臨床上的應(yīng)用受限。筆者所在課題組通過將其與HSA融合，使藥物的半衰期得到了顯著的延長，但同時也伴隨著一些共性問題的出現(xiàn)。本文主要以HSA/IL1Rα、 HSA/hGH和HSA/PTH1-34這3種HSA融合蛋白為例，結(jié)合筆者所在課題組的實驗研究成果，對HSA融合蛋白在表達(dá)過程中存在的一些共性問題進(jìn)行探討并尋找解決方法，同時對HSA融合技術(shù)的研究進(jìn)展作一綜述，旨在為長效蛋白和多肽類藥物的開發(fā)提供參考。

1 HSA融合蛋白的優(yōu)化設(shè)計

由于HSA的融合會影響目的蛋白的正確折疊、糖基化位點的暴露程度以及活性位點的功能，從而導(dǎo)致融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物不均一、不穩(wěn)定以及活性降低，因此需要設(shè)計優(yōu)化HSA與目的蛋白的連接形式。HSA融合蛋白的優(yōu)化設(shè)計主要包括目的蛋白與HSA的融合方向和連接肽（包括長度）的選擇。

1.1 目的基因的融合方向

目的基因一般可融合在HSA的N端、C端或者兩端，二者融合方式不同，所表達(dá)融合蛋白的均一性、穩(wěn)定性、生物活性甚至表達(dá)水平也都會呈現(xiàn)差異。Ding等[4]通過實驗研究分別考察了BNP與HSA的不同融合方向以及融合不同個數(shù)的BNP分子后對融合蛋白表達(dá)與活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BNP融合在HSA C端而形成的HSA/(BNP)2激活人利鈉肽受體-A（hNPR-A）的活性與BNP相當(dāng)，生物活性保留水平最高，而BNP/HSA、(BNP)2/HSA和(BNP)4/HSA這3種融合形式對BNP生物活性的保留水平較低；就表達(dá)水平而言，BNP/HSA的表達(dá)水平最高，(BNP)4/HSA的表達(dá)水平最低。筆者所在課題組則分別考察了IL1Rα、hGH和PTH1-34融合在HSA的N端及C端后的表達(dá)與活性，結(jié)果顯示，IL1Rα融合在HSA的N端以及hGH和PTH1-34融合在HSA的C端，其融合蛋白在保留生物活性的同時體內(nèi)半衰期也得到顯著延長，融合蛋白的均一性和穩(wěn)定性均優(yōu)于另一種融合方式。而且，筆者所在課題組還進(jìn)一步考察了hGH融合在HSA分子兩端后的表達(dá)與活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其融合蛋白無表達(dá)，究其原因，可能是由于目的蛋白融合在HSA的兩端后會對融合蛋白的分泌過程產(chǎn)生影響[5]。

1.2 連接肽的選擇

在構(gòu)建融合蛋白時，將HSA和目的蛋白直接相連，可能會影響目的蛋白的正確折疊和天然構(gòu)象，從而易導(dǎo)致其功能受損甚至生物活性下降，因此需在兩蛋白成分間引入連接肽。Zhao等[6-7]在研究中發(fā)現(xiàn)，直接將IFN-α2b和HSA融合，會嚴(yán)重降低IFN-α2b的抗病毒活性，而在兩蛋白成分間分別引入連接肽GGGGS、PAPAP和AEAAAKEAAAKA，以減少兩個結(jié)構(gòu)域之間的相互干擾，結(jié)果，這3種連接肽的引入分別使IFN-α2b的抗病毒活性提高了39%、68%和115%。

連接肽的選擇與設(shè)計一般從兩方面考慮：1) 連接肽的長度應(yīng)適宜，因為引入的連接肽序列對于人體是異源物質(zhì)，肽鏈越長越容易產(chǎn)生免疫源性，且會造成兩個蛋白的協(xié)同作用減弱，而肽鏈太短則會形成空間位阻，影響融合蛋白的活性；2) 連接肽應(yīng)具備一定的穩(wěn)定性，其需對蛋白水解酶有較高耐受度[8-9]。研究表明，可以利用連接肽設(shè)計工具[如LINKER、網(wǎng)絡(luò)程序(http://www.ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww/)等]以及數(shù)據(jù)庫，并根據(jù)融合蛋白的性質(zhì)以及對連接肽的要求（如連接肽的長度、可溶性以及需避免的蛋白水解酶敏感序列）來設(shè)計適宜的連接肽[10]。目前比較常用的連接肽包括柔性連接肽(GGGGS)n和(G)n[11-12]以及剛性連接肽(EAAK)n和(XP)n[13-14]，其中(GGGGS)n是目前最為普遍使用的連接肽。筆者所在課題組選擇(GGGGS)n作為連接肽，比較了n分別為0、1和2時 (GGGGS)n對融合蛋白HSA/hGH的穩(wěn)定性和體外生物活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與n為0相比，n為1和2的(GGGGS)n所構(gòu)建的融合蛋白的體外穩(wěn)定性較高，但是三者體外生物學(xué)活性沒有顯著差別。由于連接肽數(shù)引入過多會造成其抗蛋白酶降解能力下降，因此筆者所在課題組選擇n為1的(GGGGS)n作為最佳連接肽。

2 HSA融合蛋白的降解改善途徑

各種HSA融合蛋白在酵母系統(tǒng)表達(dá)時都會發(fā)生不同程度的降解，一般目的蛋白融合在HSA的C端時會產(chǎn)生約45 000的降解條帶，如HSA/hGH、HSA/ PTH1-34；而融合在HSA的N端時則會產(chǎn)生一個約45 000加上目的蛋白長度的降解片段。造成酵母表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白降解的主要原因包括宿主菌株的蛋白水解酶以及培養(yǎng)過程中外源環(huán)境壓力，其中，外源環(huán)境壓力可以通過改變培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基的組成而加以改善，而蛋白水解酶的影響可通過添加蛋白酶抑制劑或者蛋白酶的競爭底物等來減弱[15]。然而，這些方法具有菌株和蛋白特異性，并不能有效解決融合蛋白降解問題。近年來的研究表明，構(gòu)建蛋白酶缺陷宿主，是改善外源蛋白特異性降解的有效方法[16-17]。

有研究報道，液泡蛋白酶是導(dǎo)致外源蛋白在畢赤酵母中發(fā)生降解的主要原因[18]，其中影響較大的是蛋白酶A（PrA）和蛋白酶B（PrB）。因此，筆者所在課題組利用商品化的敲除了PrA的SMD1168以及敲除了PrA和PrB的SMD1163缺陷菌株來表達(dá)IL1Rα/ HAS和HSA/PTH1-34，結(jié)果顯示，這兩種融合蛋白的降解現(xiàn)象得到了顯著改善。此外，本課題組還通過N端氨基酸測序并利用MALDI-TOF對IL1Rα/ HSA降解位點進(jìn)行鑒定，結(jié)果根據(jù)所獲位點信息，發(fā)現(xiàn)降解很可能是由酵母宿主內(nèi)的精氨酸水解酶引起。而Kerry-Williams等[19]在用釀酒酵母表達(dá)rHSA時發(fā)現(xiàn)，YPS3的缺失可以顯著抑制45 000 HSA降解條帶的產(chǎn)生。所以，筆者所在課題組利用同源重組法在畢赤酵母GS115中構(gòu)建了7種單一敲除YPS1、YPS2、YPS3、YPS7、MKC7、YPS’或YPS”的蛋白酶缺陷菌株以及同時敲除YPS1和PrA的缺陷菌株，并用于HSA融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，用于融合蛋白表達(dá)的前7種單一基因敲除菌株均未顯著改善IL1Rα/HSA和HSA/PTH1-34的降解現(xiàn)象，而同時敲除了YPS1和 PrA的缺陷菌株中，HSA/PTH1-34的降解現(xiàn)象得到顯著改善，融合蛋白表達(dá)的完整度由原來的30%提高到80%[20]。近些年來的研究表明，系統(tǒng)性篩選出一些蛋白水解酶，并將其共同改造，是改善蛋白降解的最佳途徑。Idiris等[21]以hGH為研究對象，在裂殖酵母中分別敲除了52種蛋白水解酶，成功篩選出13個能夠有效表達(dá)hGH的缺陷菌株；在此基礎(chǔ)上，將篩選出的蛋白水解酶基因進(jìn)行多個共同敲除，成功構(gòu)建了一株敲除了8個蛋白水解酶的缺陷菌株，從而使hGH的表達(dá)水平提高了約30倍，證明了系統(tǒng)性篩選多個蛋白酶缺陷菌株方法的可靠性。

3 HSA融合蛋白的高表達(dá)策略

酵母表達(dá)系統(tǒng)中外源蛋白的表達(dá)水平可從毫克到克級不等，而表達(dá)水平較低仍是酵母系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白所面臨的一個共性問題。筆者所在課題組在研究IL1Rα/HSA、HSA/hGH和HSA/PTH1-34的 前 期，以pPIC9為表達(dá)載體，在畢赤酵母中進(jìn)行融合蛋白的分泌表達(dá)，結(jié)果，蛋白表達(dá)水平較低，約只有20～50 mg·L-1。這不僅限制了融合蛋白的臨床前研究進(jìn)展，而且增加了后續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的成本。而在高密度發(fā)酵水平上，外部培養(yǎng)條件便是造成外源蛋白表達(dá)水平低的主要原因。因此，可通過對外部培養(yǎng)條件的優(yōu)化來提高蛋白的表達(dá)水平，其中主要包括優(yōu)化培養(yǎng)基的組成、溫度、DO、pH、碳源的流加方式等。但筆者所在課題組在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵水平上的優(yōu)化并未能顯著改善IL1Rα/HSA、HSA/hGH和HSA/ PTH1-34的表達(dá)水平。近年來的研究則表明，遺傳宿主改造是改善酵母表達(dá)水平的有效手段，在遺傳宿主改造方面影響蛋白表達(dá)的因素主要包括外源蛋白的性質(zhì)、密碼子的偏好性、基因中AT的含量、啟動子和信號肽的選擇、目的基因的拷貝數(shù)以及蛋白的折疊與分泌效率等[22]，其中，增加基因的拷貝數(shù)以及共表達(dá)與蛋白折疊和分泌相關(guān)的分子伴侶，對提高蛋白表達(dá)水平的效果最為顯著[23-24]。筆者所在課題組的研究結(jié)果顯示，通過增加IL1Rα/HSA、HSA/hGH和HSA/ PTH1-34的融合基因拷貝數(shù)至2～3時，蛋白的表達(dá)水平最高，較單拷貝表達(dá)水平約提高了2倍，但進(jìn)一步增加拷貝數(shù)，融合蛋白的表達(dá)水平并沒有繼續(xù)增加。提示，在蛋白表達(dá)過程中，目的基因的拷貝數(shù)存在一個最優(yōu)值，高于或低于此值時，蛋白的表達(dá)均會受影響[25-26]。接下來，通過對酵母細(xì)胞內(nèi)殘留的融合蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高拷貝菌株中融合蛋白的胞內(nèi)殘留量明顯高于低拷貝菌株，說明，隨著基因拷貝數(shù)的增加，還有其他因素制約了蛋白的分泌。

新生肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊，是蛋白分泌過程中的關(guān)鍵步驟，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要分子伴侶有蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）、免疫球蛋白結(jié)合蛋白（BIP）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（ERO）。其中，PDI主要作用是促進(jìn)新生肽二硫鍵的形成，Inan等[27]研究表明，通過共表達(dá)PDI，可以提高Na-ASP1多拷貝菌株的表達(dá)水平。BIP是ATP酶Hsp70家族成員，主要作用是幫助新生肽折疊、調(diào)節(jié)未折疊蛋白響應(yīng)、促進(jìn)ER鈣庫形成、靶向降解錯誤折疊蛋白（即ER-associated degradation， ERAD）等，研究發(fā)現(xiàn)，在釀酒酵母中，共表達(dá)BIP，可以使人紅細(xì)胞生成素的表達(dá)水平提高5倍，牛凝乳酶的表達(dá)水平提高約26倍。ERO則主要負(fù)責(zé)為新生肽的形成提供所需的氧化當(dāng)量。筆者所在課題組通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，多拷貝菌株與分子伴侶PDI和ERO共表達(dá)后，均能使IL1Rα/HSA和HSA/hGH的表達(dá)水平在多拷貝的基礎(chǔ)上提高約2倍，最終使融合蛋白表達(dá)水平達(dá)到350～400 mg·L-1[26-28]；但多拷貝菌株和分子伴侶BIP共表達(dá)后，致使IL1Rα/HSA 和HSA/hGH的表達(dá)水平不僅沒有提高反而降低，這可能是由于BIP除了具有維持新生肽穩(wěn)定的作用外，還具有靶向降解錯誤折疊蛋白的作用所致[29-31]。

綜上所述，HSA融合蛋白的優(yōu)化設(shè)計、蛋白酶缺陷宿主的構(gòu)建以及HSA融合蛋白的高表達(dá)策略，為眾多HSA融合蛋白的研究提供了指導(dǎo)，并可廣泛應(yīng)用于對一系列HSA融合蛋白問題的研究。

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[專家介紹] 陳樞青：教授，博士生導(dǎo)師，中國藥學(xué)會生物技術(shù)藥物專業(yè)委員會委員，浙江省藥學(xué)會生物藥物專業(yè)委員會主任委員，《中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)》雜志編委和《Medical Science Monitor》雜志國際編委。其研究領(lǐng)域包括：1）建立抗體偶聯(lián)藥物技術(shù)平臺，設(shè)計新型高效低毒的抗腫瘤“生物導(dǎo)彈”；2）研究藥物代謝酶類及其轉(zhuǎn)運蛋白類基因的多態(tài)性，闡明藥物使用在個體中的差異機(jī)制；3）利用基因重組技術(shù)設(shè)計具有生物活性的蛋白質(zhì)新藥。陳樞青教授所在研究室近五年中發(fā)表SCI論文33篇，授權(quán)中國發(fā)明專利9項，PCT 1項。

Research Progress in Fusion Technique of Human Serum Albumin

LIU Wenhui1, WU Min2, SHEN Qi3, XU Yingchun1, CHEN Shuqing1
(1.Department of Biochemical Pharmaceutics, School of Pharmacy, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2.Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Taizhou 318000, China; 3.Houston Methodist Research Institute, Houston 77030, America)

The research progress in fusion technique of human serum albumin (HSA) was reviewed in this paper.Nowadays HSA fusion technique is a common and effective method for reforming small-molecule protein or peptide drugs.Many studies have shown that there are some common problems in the fusion of small molecule proteins or peptides with HSA, such as low yield and degradation of the target protein.However, these problems can be addressed by optimized design of the fusion protein, construction of protease-defcient hosts, multiple copies of fused genes and coexpression with chaperones.

human serum albumin fusion technique; common problems; optimized design; protease-defcient host; multiple copies; chaperones

Q789

A

1001-5094（2015）03-0199-05

·藥學(xué)研究·
PHARMACEUTICAL RESEARCH