杜子秀

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240）

生物大分子核酸藥物制劑的研究現(xiàn)狀與展望

杜子秀*

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240）

目前生物大分子核酸藥物研發(fā)亟待突破的瓶頸是，如何使核酸藥物能克服生物學(xué)屏障，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)有效輸送。無(wú)生物安全隱患并具低免疫原性、高基因包封能力和易于制備的非病毒載體仍存在輸送效率低和化學(xué)毒性大等缺陷，其臨床應(yīng)用受到限制。介紹核酸藥物的研發(fā)現(xiàn)狀，主要對(duì)非病毒核酸載體的研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)進(jìn)行總結(jié)性回顧分析，并指出，雖然非病毒載體尚存在不足之處，但其自身優(yōu)勢(shì)仍使其具有成為未來(lái)核酸藥物輸送體系主體的廣闊應(yīng)用前景。

核酸藥物；非病毒載體；聚合物；脂質(zhì)體；體內(nèi)輸送；生物學(xué)屏障

編者按：2014年11月，由國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)主辦，中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、中國(guó)藥科大學(xué)科技處、《藥物生物技術(shù)》、《藥學(xué)進(jìn)展》、常州千紅生化制藥股份有限公司、江蘇省生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)會(huì)等協(xié)辦的“生物藥物研發(fā)與創(chuàng)新青年學(xué)者高峰論壇”在中國(guó)藥科大學(xué)召開(kāi)，為廣大醫(yī)藥領(lǐng)域研究人員特別是青年學(xué)者搭建了交流學(xué)術(shù)觀點(diǎn)、分享研究成果的寶貴平臺(tái)。會(huì)議期間，來(lái)自中科院、第四軍醫(yī)大學(xué)、北京大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)等多家具有國(guó)內(nèi)頂尖生物制藥研究實(shí)力的科研機(jī)構(gòu)的專(zhuān)家學(xué)者們圍繞“生物藥物領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)、前景預(yù)測(cè)和展望”、“生物藥物研發(fā)與產(chǎn)業(yè)中的新思路、新技術(shù)、新方法”、“生物藥物成藥性研究”等主題展開(kāi)了充分交流與探討。醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)關(guān)系國(guó)計(jì)民生，在國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有舉足輕重的地位，而生物制藥更是具有巨大的發(fā)展前景。本刊編輯部特邀部分專(zhuān)家作客本期“生物制藥論壇”欄目，與讀者分享他們?cè)谠擃I(lǐng)域的科研思路和精彩觀點(diǎn)，為生物藥物的研發(fā)提供參考。

1 核酸藥物的研發(fā)現(xiàn)狀

核酸藥物（包括siRNA、DNA、miRNA和shRNA等）具有結(jié)構(gòu)和治療靶點(diǎn)明確、制備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[1]，是生物大分子藥物發(fā)展的一個(gè)重要組成部分，但其致命弱點(diǎn)是易在體內(nèi)降解以及難以到達(dá)治療位點(diǎn)，因此，對(duì)核酸藥物輸送體系的研發(fā)是核酸藥物發(fā)展的關(guān)鍵所在（Fire等, Nature, 1998年）。雖然近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)核酸藥物載體的研究報(bào)道較多，但尚未見(jiàn)有將核酸藥物應(yīng)用于臨床研究的介紹，甚至據(jù)《生物谷》報(bào)道，一些公司關(guān)閉了相應(yīng)的研究機(jī)構(gòu)，如羅氏與諾華公司先后退出對(duì)RNAi藥物的研發(fā)。而涉足核酸藥物研究的科學(xué)家也被醫(yī)藥界形容為只是在相關(guān)期刊上發(fā)表論文而沒(méi)有實(shí)際進(jìn)展。這些均緣于核酸藥物的體內(nèi)輸送問(wèn)題成為其研發(fā)過(guò)程中難以突破的瓶頸。

2014年，RNAi藥物在經(jīng)歷了幾年沉寂后再次成為各大生物醫(yī)藥公司投資的焦點(diǎn)，如羅氏公司在4年后重返RNAi藥物的研發(fā)，賽諾菲公司也開(kāi)始介入RNAi藥物研發(fā)領(lǐng)域。究其原因，是美國(guó)Alnylam公司宣稱(chēng)對(duì)RNAi藥物體內(nèi)輸送問(wèn)題有望有所突破。著名市場(chǎng)研究公司Allied在《美國(guó)商業(yè)資訊 》上發(fā)表報(bào)告稱(chēng)，未來(lái)RNAi藥物將呈現(xiàn)高速增長(zhǎng)趨勢(shì)，到2020年這類(lèi)藥物銷(xiāo)售額將有望突破12億美元，平均年增長(zhǎng)率將保持在28.4%左右。就目前的文獻(xiàn)與公開(kāi)專(zhuān)利來(lái)看，核酸藥物在體內(nèi)輸送中的路徑仍尚未打通。那么核酸藥物的體內(nèi)輸送路徑究竟能否打通？若能，非病毒載體還是病毒載體在其中的應(yīng)用前景更廣闊？核酸藥物未來(lái)發(fā)展的走向如何？讓我們帶著這些問(wèn)題來(lái)對(duì)核酸藥物輸送體系的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)作一分析。

2 非病毒核酸載體的研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)

核酸藥物的體內(nèi)輸送載體主要分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體雖然輸送效率高，但因自身難以克服的缺陷而限制了其用于核酸藥物輸送體系[2]，如：1）其只能整合到分裂期細(xì)胞；2）其可插入的外源基因片斷較?。ǎ?0 kb），難以滿足較大基因的插入；3）病毒的生物毒性是限制其臨床應(yīng)用的主要方面；4）其有產(chǎn)生野生型病毒或輔助型病毒的可能，隨機(jī)整合可能產(chǎn)生不良作用。

一些重大疾病如癌癥被發(fā)現(xiàn)時(shí)大都已發(fā)生轉(zhuǎn)移，必須通過(guò)系統(tǒng)給藥。而面對(duì)復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，如何安全有效地將核酸藥物輸送到治療位點(diǎn)，將成為一大難題。鑒于病毒載體存在諸多缺點(diǎn)，沒(méi)有生物安全隱患的非病毒載體承載著打通靶細(xì)胞內(nèi)外兩個(gè)不同環(huán)境的生物學(xué)壁壘、同時(shí)又不影響正常組織細(xì)胞、且能定向?qū)ふ也⒌竭_(dá)病灶、及時(shí)釋放藥物的重任[3]。目前，用于核酸藥物輸送研究的非病毒載體材料主要有陽(yáng)離子聚合物或脂質(zhì)體以及二者復(fù)合物等。然而，經(jīng)過(guò)三十多年的研究，所發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)非病毒載體材料尚難以成為藥用載體[4]。特別是，要完成核酸在動(dòng)物體內(nèi)的有效輸送，單純依靠聚合物或脂質(zhì)體作為載體，是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。下面將對(duì)國(guó)內(nèi)外的非病毒載體研究進(jìn)行較為深入的分析，以便找出這些載體系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)，探究非病毒核酸載體的未來(lái)走向。

2.1 聚合物和脂質(zhì)體單獨(dú)用作載體

2.1.1 陽(yáng)離子聚合物 陽(yáng)離子聚合物作為載體，可與核酸通過(guò)靜電作用而自組裝形成納米級(jí)復(fù)合物（Polyplexes），用于輸送核酸藥物。目前常用的陽(yáng)離子聚合物除了已廣泛應(yīng)用的聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴(lài)氨酸（PLL）[5-6]、殼聚糖和樹(shù)枝狀聚合物[7]（又見(jiàn)：Wolfert等, Bioconjugate Chem, 1999年）外，還有近來(lái)發(fā)現(xiàn)的聚羧酸酯[8]、聚磷酸酯[9]、β-氨基酯[5]以及含氮雜環(huán)等酸堿敏感性聚合物等新型可生物降解陽(yáng)離子聚合物[10-11]。雖然這些陽(yáng)離子聚合物用作核酸轉(zhuǎn)染試劑時(shí)顯示出相當(dāng)?shù)幕钚?，但作為核酸藥物載體，其仍然存在自身化學(xué)毒性大的缺點(diǎn)，并且難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的緊密包裹與有效釋放。同樣，近年來(lái)一些帶正電荷的多肽也被用作核酸載體[12]，雖然其毒性很低，但單獨(dú)輸送核酸的能力很差，需要加入氯喹來(lái)提高轉(zhuǎn)染效率，這可能與其較小的分子質(zhì)量、較低的胺基密度以及易在內(nèi)涵體中降解有關(guān)[13-14]。

陽(yáng)離子聚合物與核酸形成的Polyplexes表面通常帶正電荷，為了實(shí)現(xiàn)體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)與特定細(xì)胞靶向性，有研究者采用陽(yáng)離子聚合物共價(jià)接枝聚乙二醇（PEG）和靶向基團(tuán)[15]的方法來(lái)屏蔽Polyplexes表面正電荷，并實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)組織細(xì)胞的靶向性。這種方法在一定程度上降低了載體的毒性，且相對(duì)延長(zhǎng)了核酸輸送體系的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，但其很難有效實(shí)現(xiàn)組織靶向性，因?yàn)殛?yáng)離子聚合物在與核酸復(fù)合的過(guò)程中，容易將高分子鏈末端或側(cè)鏈上的靶向基團(tuán)包裹起來(lái)，而且單純的化學(xué)接枝方法只能提供單功能靶向某類(lèi)受體的可能，而針對(duì)不同的病變細(xì)胞，不能靈活變換相應(yīng)的靶向基團(tuán)。此外，在陽(yáng)離子聚合物的合成過(guò)程中，難以精確控制聚合物的分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)，重復(fù)性較差。

綜上所述，陽(yáng)離子聚合物作為核酸載體的優(yōu)點(diǎn)是可以靈活調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量和電荷密度，并且包載量大，但由于其分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)難以精確控制，重復(fù)性較差，從而導(dǎo)致不可控的化學(xué)毒性和難以形成穩(wěn)定而連續(xù)的組裝體系，所以其成藥性差。聚合物作為核酸載體的另一個(gè)缺點(diǎn)是包裹藥物不夠緊密，難以避免循環(huán)過(guò)程中漏藥以及藥物被降解等問(wèn)題。因此，雖然國(guó)內(nèi)外對(duì)諸多功能化陽(yáng)離子（或結(jié)合陰離子）聚合物用作核酸載體的研究進(jìn)行了大量報(bào)道[16-20]，但這些載體系統(tǒng)均未能突破核酸輸送過(guò)程中的生物學(xué)屏障。

2.1.2 陽(yáng)離子脂質(zhì)體 兩親性小分子陽(yáng)離子脂質(zhì)通常含有帶正電荷的頭部和疏水的碳烴鏈段，可與中性脂質(zhì)在水中形成較穩(wěn)定的陽(yáng)離子脂質(zhì)體。相比于陽(yáng)離子聚合物，陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)更接近細(xì)胞膜，更易被體內(nèi)接受，其毒性明顯降低[21]。陽(yáng)離子脂質(zhì)體與核酸通過(guò)靜電作用進(jìn)行自組裝形成復(fù)合物（Lipoplexes）[22]，通常認(rèn)為陽(yáng)離子脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)導(dǎo)是Lipoplexes與內(nèi)涵體膜融合的結(jié)果[23]，膜融合可使脂質(zhì)體直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[24]（又見(jiàn)：Xu等, Biochemistry, 1996年）。目前針對(duì)陽(yáng)離子脂質(zhì)體用作核酸載體的研究大多是圍繞通過(guò)對(duì)脂質(zhì)的化學(xué)修飾(如PEG化和連接靶向基團(tuán)等)[25-26]來(lái)突破生物學(xué)壁壘而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)循環(huán)與特定靶向等展開(kāi)，但大量文獻(xiàn)顯示，單純對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行化學(xué)修飾，不僅會(huì)帶來(lái)新的化學(xué)毒性，而且也難以有效突破生物學(xué)壁壘而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物大分子核酸藥物的體內(nèi)輸送[3,27]。

脂質(zhì)體作為核酸載體的優(yōu)點(diǎn)是，其與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，易于突破細(xì)胞膜與內(nèi)涵體膜，并能完全將藥物封閉在其水相內(nèi)，且其本身毒性非常低，不足以對(duì)人體造成大的傷害。目前已經(jīng)有許多商業(yè)化的脂質(zhì)材料可供選購(gòu)，但未修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體只能起到包裹核酸與突破胞膜的作用（Xu等, Biochemistry, 1996年），并無(wú)主動(dòng)靶向功能，仍難以用于制備核酸藥物制劑。

2.2 聚合物與脂質(zhì)體的復(fù)合物載體

為了開(kāi)發(fā)出更有效的核酸體內(nèi)輸送載體系統(tǒng)，將聚合物（如陽(yáng)離子聚合物、帶正電荷的蛋白質(zhì)或多肽等）與脂質(zhì)體相結(jié)合而構(gòu)建的納米載體（Lipopolyplexes）應(yīng)運(yùn)而生[28-30]。其中，報(bào)道較多的是，先利用陽(yáng)離子聚合物與核酸形成帶負(fù)電荷的納米顆粒Polyplexes，然后通過(guò)靜電作用將Polyplexs與陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合，制得Lipopolyplexes[28-29]。其優(yōu)點(diǎn)是，核酸包載量增大，并能實(shí)現(xiàn)與功能化脂質(zhì)體（如PEG化并連接不同靶向基團(tuán)的脂質(zhì)體）有效結(jié)合。其缺點(diǎn)是，所用陽(yáng)離子聚合物仍然局限于常用的轉(zhuǎn)染試劑，化學(xué)毒性較大，且尚未克服陽(yáng)離子聚合物或脂質(zhì)體單獨(dú)用作核酸載體時(shí)所具有的缺陷；雖然也有利用帶正電荷的蛋白質(zhì)代替陽(yáng)離子聚合物以克服陽(yáng)離子聚合物所致化學(xué)毒性等缺點(diǎn)的報(bào)道[31-33]，但蛋白本身成本高，且難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的緊密包裹和有效釋放；而利用無(wú)機(jī)鹽代替陽(yáng)離子聚合物制備Lipopolyplexes[34]，除了制備過(guò)程繁瑣外，也沒(méi)有克服脂質(zhì)體作為核酸載體時(shí)所具有的缺點(diǎn)，其體內(nèi)輸送核酸性能并不理想。由此可見(jiàn)，上述Lipopolyplexes的構(gòu)建方法只是將兩種組分簡(jiǎn)單壘加，并沒(méi)有從根本上將二者進(jìn)行有機(jī)融合。

另一種組裝模式是，采用模塊化設(shè)計(jì)方式將連接靶向肽序列的陽(yáng)離子多肽和陽(yáng)離子脂質(zhì)體聯(lián)合包裹核酸，構(gòu)建受體靶向納米復(fù)合物載體（receptor-targeted nanocomplexes, RTNs）[35]（又見(jiàn)：Hart等, Hum Gene Ther, 1998年）。該方法的特點(diǎn)是，各組分既相對(duì)獨(dú)立（沒(méi)有通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合），又能夠有機(jī)統(tǒng)一地組裝（不再是各組分簡(jiǎn)單的壘加）。通過(guò)多肽組分包裹核酸，并能靶向細(xì)胞表面的受體[36]，而利用脂質(zhì)組分的融膜作用又可突破細(xì)胞和內(nèi)涵體膜[37]，實(shí)現(xiàn)內(nèi)吞功能，該方法有效地克服了陽(yáng)離子聚合物分子質(zhì)量不確定和化學(xué)毒性大等問(wèn)題，提高了核酸的體內(nèi)輸送能力?？梢?jiàn)，該組裝體系為藥用非病毒載體的構(gòu)建提供了合理的新思路，是一種較好的通過(guò)整體協(xié)調(diào)效應(yīng)組裝的范例。然而，采用常規(guī)的短鏈PEG化來(lái)屏蔽納米復(fù)合物表面正電荷，不僅會(huì)削弱多肽的靶向功能，且屏蔽效果并不理想，還會(huì)造成蛋白吸附等不良反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)輸送效率不高[35-36,38]（又見(jiàn)：Hart等, Hum Gene Ther, 1998年），難以成為核酸輸送的藥用載體。而且，到目前為止，RTNs的內(nèi)部組裝結(jié)構(gòu)尚不明確，勢(shì)必阻礙其在核酸藥物體內(nèi)輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用。

3 展望

從以上分析可以看出，利用聚合物與脂質(zhì)構(gòu)建非病毒核酸載體，具有一定的應(yīng)用潛力，但需要針對(duì)體內(nèi)的生物學(xué)壁壘，合理利用二者的優(yōu)勢(shì)并避免各自的缺點(diǎn)，進(jìn)行有效組裝，且所用生物材料必須是人體能夠接受的醫(yī)用分子。如利用多肽和脂質(zhì)體這些對(duì)人體安全的生物材料，通過(guò)整體協(xié)調(diào)效應(yīng)組裝而構(gòu)建的RTNs，這是我們?cè)诮窈笱芯恐兄档媒梃b的一種非病毒載體構(gòu)建模式。但這類(lèi)構(gòu)建模式還需進(jìn)一步優(yōu)化提高，如隨著脂質(zhì)體的不斷優(yōu)化發(fā)展，對(duì)脂質(zhì)體模塊的優(yōu)化完善勢(shì)在必行。

因此，要想實(shí)現(xiàn)生物大分子藥物體內(nèi)輸送，最好的戰(zhàn)略對(duì)策之一應(yīng)是融合生物大分子和脂質(zhì)體的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)協(xié)同效應(yīng)組裝出智能型的納米級(jí)生物大分子藥物輸送體系，而且，在設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)盡量利用現(xiàn)有的已經(jīng)證明對(duì)人體安全的生物醫(yī)用材料或結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量明確可控的聚合物，如透明質(zhì)酸等，雖然其具體分子質(zhì)量難以確定，但并不影響其作為藥物載體的鑒定、評(píng)判，可用于組裝能應(yīng)對(duì)體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的納米載體。筆者所在實(shí)驗(yàn)室即以RTNs為模型，利用醫(yī)用大分子——透明質(zhì)酸、特定腫瘤細(xì)胞穿透肽和市售的無(wú)細(xì)胞毒性的脂質(zhì)協(xié)同核酸組裝成能夠在體內(nèi)安全高效地輸送生物大分子藥物的多功能智能型納米載體[39]，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果表明其具有良好的核酸輸送效能，希望此組裝模式能為生物大分子藥物輸送技術(shù)的發(fā)展提供新的思路。

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[專(zhuān)家介紹] 杜子秀：博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師。2007年博士畢業(yè)于浙江大學(xué)高分子化學(xué)與物理專(zhuān)業(yè)。隨后分別到上海交通大學(xué)和英國(guó)倫敦大學(xué)學(xué)院（UCL）師從金拓教授與非病毒載體專(zhuān)家Stephen L.Hart教授進(jìn)行博士后研究工作。研究方向?yàn)樯锊牧吓c藥物輸送體系的構(gòu)建，特別專(zhuān)注于生物大分子藥物體內(nèi)輸送體系的研究。近年來(lái)以第一作者身份分別在Mol Pharm, Scientifc Reports, Macromolecules等SCI主流期刊上發(fā)表論文10篇，總它引為200多次，最高單引為102次。授權(quán)專(zhuān)利5項(xiàng)。分別獲得中國(guó)博士后科學(xué)基金一等資助金和特別資助基金，國(guó)家自然科學(xué)青年基金。參與了十一五國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專(zhuān)項(xiàng)“針對(duì)生物技術(shù)藥物的給藥系統(tǒng)技術(shù)平臺(tái)”和十二五國(guó)家新藥創(chuàng)制專(zhuān)項(xiàng)“新型藥物制劑和輔料的臨床前研究”等多項(xiàng)研究。2010年獲得上海交通大學(xué)晨星計(jì)劃B類(lèi)獎(jiǎng)勵(lì)。目前的主要研究興趣是利用生物醫(yī)用材料構(gòu)建可成藥的核酸藥物輸送體系。

Research Status and Prospect of Therapeutic Nucleic Acid Formulations

DU Zixiu
(School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China)

Currently, the bottleneck that desperately needs to break through in nucleic acid drug development is how to overcome biological barriers in nucleic acid delivery in vivo.Despite the advantages of less biological toxicity, low immunogenicity, high capability of gene encapsulation and easy preparation, non-viral vectors are still restricted clinically by high chemical toxicity and low delivery effciency.In this article, the present situation of nucleic acid drug development was introduced, with emphasis on retrospective analysis of the research status and development trend of non-viral vectors for nucleic acid drugs.It was pointed out that non-viral vectors were still promising delivery systems for nucleic acid drugs in the future despite their various limitations.

nucleic acid drug; non-viral vector; polymer; liposome; in vivo delivery; biological barrier

Q52; R943

A

1001-5094（2015）03-0188-05

接受日期：2015-02-07

項(xiàng)目資助：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30901881)；上海市閔行區(qū)2013年度產(chǎn)學(xué)研合作計(jì)劃項(xiàng)目（No.20121012634480）

*通訊作者：杜子秀，副研究員；

研究方向：生物材料和藥物輸送；

Tel：021-34204739；E-mail：zixiudu@sjtu.edu.cn