李丹，初陽(yáng)（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng)11004；.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng)11004）

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）及其鈉鹽是廣泛存在于人體及動(dòng)物體內(nèi)的一種黏多糖，是體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、日化和醫(yī)藥領(lǐng)域[1-2]；其在組織形成、細(xì)胞調(diào)控及血管生成方面都起著重要的作用[3]。HA本身具有良好的生物相容性、高黏彈性和毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，既可延緩皮膚衰老，補(bǔ)充皮膚水分；又可促進(jìn)傷口愈合，防止疤痕產(chǎn)生[4-5]。雖然已有上市的含HA的化妝品[6]，但其僅作為保濕劑出現(xiàn)，并非作為主要成分使用，因此藥用效果不明顯，也不適合大規(guī)模藥用。

本文以透明質(zhì)酸鈉為模型藥物，海藻酸鈉為骨架材料，采用乳化-交聯(lián)法制備了包載透明質(zhì)酸鈉的海藻酸鈉微球。該制劑處方選擇和制備工藝的關(guān)鍵是利用微球所形成的不溶性骨架，以降低透明質(zhì)酸鈉的釋放速度，延長(zhǎng)釋藥時(shí)間，從而達(dá)到提高生物利用度的目的。本研究可為進(jìn)一步制備透明質(zhì)酸鈉緩釋制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）；FA1104電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；UV-9100型紫外分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；DMBA450生物數(shù)碼顯微鏡（麥克迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；LS320激光粒度儀（美國(guó)Beckman公司）。

三乙醇胺（天津市博迪化工有限公司）；透明質(zhì)酸鈉（山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：0911062，藥用級(jí)，含量：99.5%）；海藻酸鈉（河北大唐生物工程有限公司，藥用級(jí)）；海藻酸鈉微球（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院奉天醫(yī)院藥學(xué)部）；對(duì)羥基苯甲酸乙酯、氯化鈣、聚山梨酯80均為藥用級(jí)；二氯甲烷、異丙醇、液體石蠟、丙三醇、硬脂酸、白凡士林、阿利新藍(lán)均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 透明質(zhì)酸鈉含量測(cè)定方法的建立

精密稱量透明質(zhì)酸鈉，用去離子水溶解后配成質(zhì)量濃度為53.15、106.3、212.6、318.9、425.2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 ml，加入10 ml量瓶中，加6 ml阿利新藍(lán)染料染色，混合后用去離子水稀釋至刻度，作為顯色溶液。在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各溶液的吸光度值。以透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液與顯色溶液的吸光度差值（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A＝0.0017ρ+0.1848（r＝0.9980，n＝5）。結(jié)果表明，透明質(zhì)酸鈉檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為53.15～425.2 mg/L。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（53.15、212.6、425.2 mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液的日內(nèi)精密度RSD分別為1.88%、0.80%、0.63%（n＝5）；日間精密度RSD分別為2.57%、1.05%、0.84%（n＝5）；平均回收率為（97.9±1.80）%，RSD＝1.84%（n＝3）。

2.2 透明質(zhì)酸鈉微球的制備

稱取適量透明質(zhì)酸鈉，精密稱定，溶入蒸餾水中，超聲溶解后，將適量海藻酸鈉細(xì)粉溶于其中配成一定濃度的海藻酸鈉溶液，靜置除去氣泡，后用醫(yī)用9號(hào)注射器緩緩滴入攪拌的混合油相中。以一定的分散轉(zhuǎn)速磁力攪拌分散一定時(shí)間后，加入適量用氯化鈣飽和的交聯(lián)劑，固化[7]。將制得的微球分別用異丙醇洗滌2～3次，抽濾后，40℃干燥6 h，密封貯藏備用。

2.3 透明質(zhì)酸鈉包封率及載藥量的測(cè)定

取制備的海藻酸鈉微球50 mg，置于蒸餾水5 ml中超聲10 min；37℃放置24 h，取上清液置于10 ml量瓶中，研磨微球至其破碎，離心15 min，將上清液吸取于量瓶中，用蒸餾水稀釋定容至10 ml；用0.45 μm微孔濾膜濾過。測(cè)定上清液中的藥物含量，計(jì)算微球中藥物的包封率及載藥量：包封率＝微球中包裹的透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量/透明質(zhì)酸鈉加入量×100%；載藥量＝微球中包裹的透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量/微球的質(zhì)量×100%。

2.4 處方因素的考察

經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)，確定對(duì)包封率影響較大的幾個(gè)處方因素，考察結(jié)果如下。

2.4.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)。固定其他的因素，考察海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。分別配成含有1%透明質(zhì)酸鈉的1%、2%、3%海藻酸鈉溶液，滴入二氯甲烷與植物油等比例組成的混合油相中，以300 r/min轉(zhuǎn)速分散15 min，加入交聯(lián)劑90 min后制備海藻酸鈉微球，其水相與交聯(lián)劑體積比為1∶1，透明質(zhì)酸鈉與海澡酸鈉質(zhì)量比為1∶2。結(jié)果顯示，當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，黏度較低，無法成球；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，可成球，且干燥后球之間無粘連，鏡下觀察微球形態(tài)較好，包封率為（45.17±6.12）%（n＝3）；當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)，雖然包封率較高（57.28±5.54）%（n＝3），但由于黏度較大，微球形態(tài)不佳。因此，選擇海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。

2.4.2 混合油相比例。固定海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，制備方法同“2.4.1”項(xiàng)，選擇植物油與二氯甲烷的混合油相，體積比為3∶1、2∶2、1∶3，并加入2%油酸山梨坦作為油相的表面活性劑，制備海藻酸鈉微球。結(jié)果顯示，當(dāng)體積比為3∶1和2∶2時(shí)，混合油相黏度大，干燥后微球粘連嚴(yán)重，微球形態(tài)不佳，包封率分別為（38.94±8.46）%（n＝3）和（37.25±8.14）%（n＝3）。因此，選擇體積比為1∶3，此時(shí)包封率為（45.17±6.12）%（n＝3）。

2.4.3 交聯(lián)劑加入體積。以2%海藻酸鈉溶液作為內(nèi)水相，植物油與二氯甲烷體積比為1∶3的混合油為油相，令水相與加入交聯(lián)劑的體積比為2∶1、1∶1、1∶2，按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備海藻酸鈉微球。結(jié)果包封率依次為（38.97±4.43）%、（45.17±6.12）%和（43.86±7.35）%（n＝3），表明當(dāng)體積比超過1∶1后，再提高交聯(lián)劑的量，微球的包封率基本不再變化，粒徑減小不明顯。因此，選擇水相與交聯(lián)劑體積比為1∶1。

2.4.4 透明質(zhì)酸鈉與海藻酸鈉質(zhì)量比。分別配制透明質(zhì)酸鈉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1∶4、1∶2、1∶1的溶液為水相，水相與交聯(lián)劑的體積比為1∶1，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備海藻酸鈉微球。結(jié)果包封率依次為（48.93±8.69）%、（45.17±6.12）%和（31.96±7.54）%（n＝3），載藥量依次為（6.99±1.64）%、（11.29±2.16）%和（12.78±2.71）%（n＝3），表明透明質(zhì)酸鈉與海藻酸鈉比例增加，微球載藥量增加，包封率明顯降低。因此，綜合考慮，選擇質(zhì)量比為1∶2。

2.5 工藝因素的考察

經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)，確定了對(duì)包封率影響較大的幾個(gè)工藝因素，考察結(jié)果如下。

2.5.1 分散時(shí)間。以2%海藻酸鈉溶液為水相,透明質(zhì)酸鈉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1∶2，含2%油酸山梨坦、混合油相比例為1∶3的混合油為油相，水相與交聯(lián)劑體積比為1∶1，以300 r/min轉(zhuǎn)速分散5、15、30 min，加入交聯(lián)劑90 min后制備海藻酸鈉微球，制備方法同“2.2”項(xiàng)。結(jié)果包封率分別為（37.4±4.37）%、（45.17±6.12）%和（46.26±8.49）%（n＝3），表明隨著時(shí)間增加，包封率增加，但時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使微球粘連。因此，選擇分散時(shí)間為15 min。

2.5.2 分散轉(zhuǎn)速。固定分散時(shí)間為15 min，分別在100、300、500 r/min下按“2.4.1”項(xiàng)下方法制備海藻酸鈉微球。結(jié)果包封率分別為（56.48±8.96）%、（45.17±6.12）%和（34.32±7.34）%（n＝3），表明隨轉(zhuǎn)速增加，包封率下降，但轉(zhuǎn)速過低微球粒徑大，分布不均。因此，選擇分散轉(zhuǎn)速為300 r/min。

2.5.3 交聯(lián)時(shí)間。固定分散轉(zhuǎn)速為300 r/min，交聯(lián)時(shí)間分別為30、90、150 min下按“2.2”項(xiàng)下方法制備海藻酸鈉微球。結(jié)果包封率分別為（31.76±3.62）%、（45.17±6.12）%和（47.03±5.73）%（n＝3），表明隨著交聯(lián)時(shí)間延長(zhǎng)，包封率增加，但增加到90 min后，再延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，包封率提高不明顯，且微球有粘連現(xiàn)象。因此，交聯(lián)時(shí)間選擇90 min。

2.6 包載透明質(zhì)酸鈉的海藻酸鈉微球處方的優(yōu)化

根據(jù)單因素考察結(jié)果，選取透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、透明質(zhì)酸鈉與海藻酸鈉質(zhì)量比、交聯(lián)時(shí)間和分散轉(zhuǎn)速為因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以包封率為指標(biāo)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，篩選出包封率高、形態(tài)好的微球最優(yōu)處方。影響因素及因素水平取值見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2，極差分析見表3，方差分析見表4。

表1 影響因素及因素水平取值Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Orthogonal design and results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析Tab 3 Results of analysis of range

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab 4 Results of analysis of variance

由表2可見，各因素對(duì)指標(biāo)的影響程度順序?yàn)镃＞A＞B＞D，最佳水平為A2B1C2D1，即海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，透明質(zhì)酸鈉與海藻酸鈉質(zhì)量比為1∶3，交聯(lián)時(shí)間為90 min，分散轉(zhuǎn)速為200 r/min。

由表3可見，交聯(lián)時(shí)間對(duì)微球的包封率有顯著影響，而海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、透明質(zhì)酸鈉與海藻酸鈉質(zhì)量比及分散轉(zhuǎn)速對(duì)包封率影響不明顯。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按最優(yōu)處方制備3批微球，其形態(tài)圓整、粒徑分布均勻，測(cè)得包封率為（58.92±3.06）%，載藥量為（10.96±1.12）%；將微球分散于水中，滴入激光粒度測(cè)定儀，測(cè)得微球平均粒徑為（107.8±5.51）μm。

3 討論

氯化鈣的水溶液相當(dāng)于水相，其在油相中也以液滴形式被分散，因此與海藻酸鈉液滴接觸幾率很小，且液滴各點(diǎn)交聯(lián)不均，交聯(lián)效果不佳。用氯化鈣飽和的二氯甲烷可與油互溶，加入后，可以在海藻酸鈉液滴周圍形成均勻的交聯(lián)劑濃度，即液滴各點(diǎn)交聯(lián)均勻。故本文選擇氯化鈣溶液飽和的二氯甲烷為交聯(lián)劑。

一次性加入交聯(lián)劑，只是在最初形成交聯(lián)劑的濃度梯度，隨著交聯(lián)劑的消耗，濃度梯度降低，交聯(lián)效果會(huì)變差，內(nèi)層交聯(lián)不完全，所以包封率較低，粒徑稍大，但形態(tài)較好。分次加入交聯(lián)劑可以在不同時(shí)間點(diǎn)始終保持著濃度梯度，交聯(lián)效果好，交聯(lián)程度深，包封率高，粒徑小，形態(tài)好。

分散轉(zhuǎn)速顯著影響微球粒徑及形態(tài)。當(dāng)分散轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，提供的外力不足以降低水相的粒徑，使得微球大小不一；但由于轉(zhuǎn)速低，水相中藥物滲漏量小，包封率較高。當(dāng)轉(zhuǎn)速為500 r/min時(shí)，粒徑雖小，但包封率降低，體系黏度增加，出現(xiàn)粘連現(xiàn)象。

因本文中劑型為中間劑型，最終劑型為乳膏劑，故對(duì)粒徑考慮不多，僅是在驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)測(cè)量了粒徑，試驗(yàn)時(shí)也只是在顯微鏡下觀察了微球的形態(tài)，未照電鏡。

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